RNA干扰酪氨酸激酶受体2对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

吴世卿 曾曙光 温志欣 彭细毛 李玉兰 卿安蓉

（1.南方医科大学附属医院·顺德第一人民医院 口腔科，顺德528300；2.广东省口腔医院 口腔颌面外科，广州510280）

酪氨酸激酶受体2（tyrosine kinase 2 with immunoglobulin-like and epidermal growth factor homology domains，Tie2）是表达于血管内皮细胞的血管生长调节因子，与肿瘤的微血管及生物学行为密切相关。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）具有分化潜能和新生血管内皮细胞的特异性。本研究采用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，将携带有Tie2基因的特异性短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）片段的质粒转染入HUVECs中，然后用实时定量逆转录聚合酶链反应（real time quantitation reverse transcriptase polymerase chain reaction，QRT-PCR）和免疫印迹（Western blot）法分别检测细胞中Tie2 mRNA和蛋白表达的改变情况，探讨沉默Tie2基因是否会对HUVECs的生长起调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVECs：第4～6代，由广东省口腔医院实验室保存。含有特异性针对Tie2的shRNA的pGenesil-1质粒（pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA），由武汉晶赛公司设计合成，经预试验选用Tie2目的基因序列为5’-GATGCGTCAACAAGCTTCC-3’；以HUVECs里不具备的基因hk为阴性对照，其基因序列为5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组和培养 细胞分为3组：实验组为pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA质粒＋LipofectamineTM2000脂质体，阴性对照组为pGenesil-hk质粒＋LipofectamineTM2000脂质体，空白对照组为无转染组。转染前1 d，将HUVECs按每孔1×105个细胞接种于六孔板中培养；转染当日用OPTI-MEM Ⅰ培养基（Invitrogen公司，美国）稀释LipofectamineTM2000脂质体（Invitrogen公司，美国）和质粒（同一培养基中加入0.5 μL脂质体和1 μg质粒），转染HUVECs，具体操作按LipofectamineTM2000说明书进行。荧光显微镜下观察各组细胞的转染情况，并计算转染率。

1.2.2 QRT-PCR检测HUVECs中Tie2 mRNA的表达在Genbank中查找Tie2的序列（NM_000459.3），采用Olig5软件设计PCR引物。Tie2上游引物为：5’-TCCAAGGATGTCTCTGCTCTC-3’，下游引物为：5’-TTGGGGTCATCCTCGGTAT-3’；内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物为：5’-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3’，下游引物为：5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’。

将细胞分别按实验组、阴性对照组和空白对照组接种于25 cm2培养瓶，分别在转染后24、48 h提取细胞总RNA（Invitrogen公司，美国），电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计检测RNA的质量浓度和纯度；QRT-PCR（GeneCopoeia公司，美国）检测Tie2 mRNA的表达。PCR反应条件为：预变性95 ℃10 min；变性95 ℃10 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃15 s，40个循环；终末循环延伸72 ℃8 min。上述实验操作重复3次。Tie2的mRNA相对表达量经内参照GAPDH校正，参照Livak等[1]报道的方法分析结果。

1.2.3 Western blot法检测转染后HUVECs中Tie2蛋白的变化情况 细胞转染和分组同1.2.2。分别于转染后24、48 h提取各组细胞的蛋白，采用Western blot法检测Tie2的蛋白表达情况，按照说明书测定蛋白的相对表达量。各组所用的Tie2抗体和细胞骨架蛋白αtuburlin抗体均为美国Santa Cruz公司产品。实验操作重复4次。各组细胞的Tie2蛋白、α-tuburlin蛋白的Western blot结果由数码相机拍摄成像，并用Image J软件分析各显影带的灰度值。

1.2.4 转染后HUVECs凋亡的形态学观察 细胞转染和分组同1.2.2。分别于转染后24、48 h收集细胞涂片。每张涂片用苏木素染色10 min，自来水冲洗去除残留的染色液；用含1%盐酸的70%乙醇溶液进行分色，脱去多余的染料，自来水冲洗15 min使之蓝化；放入1%伊红水溶液中浸染10 min；蒸馏水洗去载玻片上的染液，脱水、透明、封片。在显微镜下观察细胞形态，分别选择细胞密度均一的5个高倍视野，计算总细胞数和凋亡细胞数（以细胞核染色质出现明显的边缘化凝集为凋亡细胞的标志）。

1.2.5 噻唑蓝比色分析（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测转染后各组细胞的增殖情况 以每孔2×104个细胞接种到96孔板，分别在转染前和转染后1、2、3、4 d用MTT溶液显色，孵育，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，置于酶标仪上测定各孔的吸光度A值，测定波长为490 nm。以培养时间为横坐标，A值为纵坐标绘制细胞的生长曲线图。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 pGenesil-1质粒转染情况

pGenesil-1质粒有效转染入HUVECs中，各组细胞的转染情况见图1：实验组和阴性对照组均有绿色荧光表达，而空白对照组无绿色荧光表达，提示转染成功。重复转染4次，转染率均为65%左右。

2.2 QRT-PCR检测结果

各组细胞的QRT-PCR结果见表1。与阴性对照组和空白对照组相比较，实验组转染24、48 h后细胞中的Tie2 mRNA相对表达量均下调，转染48 h后下调更为明显。

图1 转染的pGenesil-1质粒表达绿色荧光蛋白 荧光显微镜×100Fig 1 Cells successfully transfected with the pGenesil-1 plasmid expressed green fluorescent protein fluorescence microscope×100

表1 转染24、48 h后Tie2 mRNA的相对表达量Tab 1 The relative expression of Tie2 after transfected 24 h and 48 h

2.3 Western blot检测结果

各组细胞Tie2、α-tuburlin的Western blot结果见图2：实验组Tie2基因24、48 h条带均明显弱于阴性对照组和空白对照组，而两个对照组间的表达强弱无明显差异；实验组48 h的Tie2条带明显弱于实验组24 h的条带。对Western blot条带进行半定量分析（Tie2与α-tuburlin显影灰度值的比值），空白对照组、阴性对照组和实验组培养48 h时的灰度值分别为：1.089±0.134、1.024±0.408、0.466±0.037，培养24 h时的灰度值分别为0.983±0.036、0.985±0.724、0.722±0.078。经统计学分析，实验组48、24 h的灰度值分别与相同培养时间的两个对照组比较，其差异均有统计学意义（P＜0.05），实验组低于对照组；实验组48、24 h的灰度值进行比较，其差异也有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 HUVECs凋亡的形态学观察

实验组出现凋亡的细胞数目明显增多，尤以48 h较为明显；而阴性对照组、空白对照组的细胞凋亡不明显。各组细胞的凋亡率见表2。采用卡方检验进行统计学分析，可见3组间细胞凋亡率的差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 Wesern blot检测结果Fig 2 Results of Western blot test

表2 细胞凋亡结果的统计分析

Tab 2 The statistical analysis of apoptosis

χ2值P值未凋亡率/%65.00.000阴性对照组4.995.1空白对照组2.897.2 323.009组别凋亡率/%实验组35.0

2.5 转染后各组细胞的增殖情况

MTT法检测转染前后HUVECs的增殖情况，其结果见图3。

图3 pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA对HUVECs增殖的影响Fig 3 The effect of pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA on the proliferation of HUVECs

由图3可见：实验组在转染了pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA后，细胞仍有增殖，但较空白对照组和阴性对照组缓慢得多（P＜0.05）；而两个对照组的细胞增殖良好，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

Tie2在肿瘤血管生成中起着极为重要的作用。研究[2-4]发现：Tie2在许多恶性肿瘤如肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤等出现表达上调现象。还有研究[5]报道：Tie2在口腔癌组织的表达明显高于正常对照组织，并随临床病理分级的增加呈现递增的趋势。部分阻断血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）途径且无生物学反应的肿瘤常表达Tie2，提示Tie2是肿瘤血管生成中另一条独立的调控途径[6]。

Tie2参与血管生成调节的机制可能是因为Tie2与其配体Ang结合后激活PI3-K/Akt信号途径，从而导致血管形成、内皮细胞迁移等[7]。Tie2基因是特异性表达于内皮细胞和某些造血祖细胞的酪氨酸激酶受体，国外大部分有关Tie2基因的体外研究都是建立在血管内皮细胞的基础上[8]。本实验的前期研究[9]结果提示：Tie2在HUVECs中呈高表达水平，与国内外相关研究结果相符。

本研究应用RNA干扰技术，将含有Tie2基因特异性shRNA的质粒转染入HUVECs。QRT-PCR结果显示：就同一时间点而言，转染HUVECs 24、48 h后，实验组Tie2 mRNA的相对表达量分别只有相应时间点的空白对照组的0.392倍和0.363倍；就同一对照组而言，转染HUVECs 24、48 h后，实验组Tie2 mRNA的相对表达量分别只有空白对照组（24 h）的0.392倍和0.543倍。此外，空白对照组培养48 h的Tie2 mRNA相对表达量也增高，由此推测，实验组转染48 h的Tie2 mRNA相对表达量比转染24 h高可能是由于基因拷贝所致，此机制仍需进一步研究。上述结果表明：转染的pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA能够显著抑制Tie2基因的表达，且转染后48 h的HUVECs中Tie2 mRNA的表达量低于转染后24 h。Western blot结果显示：HUVECs经质粒转染后，Tie2蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组，且实验组转染48 h的Tie2蛋白表达量显著低于转染24 h（P＜0.05），而两个对照组之间的差异则没有统计学意义（P＞0.05）。此外，阴性对照组和空白对照组转染48 h的Tie2基因表达量有所增高，但实验组转染48 h的Tie2基因表达量却进一步下降，说明转染的pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA显著抑制了Tie2基因的表达。而引起阴性对照组和空白对照组培养48 h后Tie2基因表达量有所增高的原因，可能是由于上样量误差或是基因随时间有所拷贝所致，此机制仍需进一步研究。

本研究结果提示：实验组转染48 h后的细胞凋亡率达到35.0%，明显高于两个对照组（P＜0.05），提示Tie2-shRNA沉默了HUVECs中的Tie2基因后能诱导细胞的凋亡，进一步证实了Tie2在HUVECs中的作用。MTT结果显示：实验组在转染了pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA后，细胞仍有增殖，但较空白对照组和阴性对照组缓慢得多（P＜0.05），提示pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA显著抑制了HUVECs的增殖。上述结果均提示Tie2的表达与内皮细胞生物学活性密切相关。诱导内皮细胞凋亡、减少肿瘤血管生成可抑制肿瘤的生长，而本研究表明Tie2基因表达下调可导致内皮细胞增殖减缓、凋亡增多，提示沉默Tie2基因表达可能成为肿瘤治疗的新途径。

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