子莲病原菌的分离与鉴定研究

2012-03-22罗银华刘波朱育菁肖荣凤杨莹莹杨盛春

长江蔬菜 2012年16期

关键词：建宁县内生菌落

罗银华，刘波，朱育菁，肖荣凤，杨莹莹，杨盛春

（1.福建建宁县莲籽科学研究所，354500；2.福建省农业科学院农业生物资源研究所）

子莲病原菌的分离与鉴定研究

罗银华1，刘波2，朱育菁2，肖荣凤2，杨莹莹2，杨盛春1

（1.福建建宁县莲籽科学研究所，354500；2.福建省农业科学院农业生物资源研究所）

通过分离发病组织的内生菌，提取DNA进行PCR扩增后进行测序和比对分析，12类样品中第8类未分离到任何菌，样品第5类和第11类为细菌病害，其余为真菌病害，其中第1类病原菌为黑附球菌，第2类和第3类病原菌为镰刀菌，第4类病原菌为拟茎点菌，第6类、第7类、第9类、第10类和第12类病原菌均为链格孢菌。

子莲；病原菌；分离；鉴定

子莲为睡莲科莲属多年生宿根草本植物，是一种高效益的水生经济作物，具有很高的营养价值、药用价值和经济价值，江南各地均有广泛的栽培。随着各地产业结构调整，其栽培面积有不断扩大之势。近年来，建宁县子莲种植面积稳定在3 330 hm2，但子莲的病害发生日趋严重，造成减产甚至绝收，已成为发展子莲生产的一大障碍。因此本研究对子莲的病原菌进行分离和鉴定，通过分离不同病症的莲内生菌，并提取DNA进行PCR扩增后进行测序，经过比对，从而确定这些菌株的分类结果，为各种病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

①供试子莲子莲品种为有典型发病症状的建选17号、建选35号莲株。2011年6月取自建宁县莲科所育种基地和种质资源圃。

②培养基 PDA培养基（分离真菌）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，链霉素0.3 g，pH值7.0左右。

NA培养基（分离细菌）：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2~7.6。

③试剂无菌水，75%酒精，10%次氯酸钠。

④仪器超净工作台，酒精灯，接种环，恒温培养箱，镊子，高压灭菌锅。

1.2 试验方法

①样品的分类根据症状的不同，将样品分为12类，其中第1至第9类为莲叶片，第10至第12类为莲茎秆。

②植株内生菌的分离自来水冲洗干净植株根部泥土后，酒精表面消毒。将植株组织切成厚度为2~3 mm均匀片状。将切片在75%的酒精溶液中浸泡2~3 s，后在10%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒7~8 min后，用无菌水漂洗3次，将植物组织片贴到PDA和NA平板表面，倒置培养3~4 d，观察内生菌的生长情况。

③纯化观察分离培养的菌落，将要纯化的菌落标记。用接种环在菌落边缘挑取一点接种于平板中央，真菌培养7 d，细菌培养1 d后进一步进行分子鉴定。

④DNA的获得细菌用裂解法提取DNA，真菌菌丝按尿素提取法提取DNA。

⑤真菌的ITS的 PCR扩增采用特异引物ITS4和ITS5进行PCR扩增。反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq酶0.25 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，ITS4（10 pmol）1.0 μL，ITS5（10 pmol）1.0 μL，采用超纯水定容至25 μL。反应程序为94℃，5 min；循环的程序为94℃变性 60 s，55℃复性 60 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增结束后，取5 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳以检查扩增结果。

⑥细菌16S rDNA的PCR扩增采用特异引物16S1和16S2对细菌菌落16S rDNA片段的进行PCR扩增。反应体系和反应程序同。

⑦PCR产物直接测序和比对分析经验证为目的片段的PCR纯化产物送上海博尚生物公司进行测序。将测序结果通过Blast软件进行序列比对。

2 结果与分析

2.1 莲叶病害症状

不同症状的样品分类如图1，第1~12类。

2.2 内生菌的分离

部分样品内生菌分离及纯化照片如图2所示，各类样品内生菌的分离情况如表1所示。

2.3 各菌株的ITS及16S PCR扩增

图3为真菌ITS扩增结果，图4为细菌16S扩增结果。

2.4 序列测定与分析

行序列比对得到的结果如表2所示。

3 小结与讨论

本试验将采集的子莲按不同的症状进行分类，通过分离发病组织的内生菌来确定病原菌。经菌株鉴定后表明，除了第8类未分离到任何菌，样品第5类和第11类为细菌病害，其余为真菌病害，其中第1类病原菌为黑附球菌，第2类和第3类病原菌为镰刀菌，第4类病原菌为拟茎点菌，第6类、第7类、第9类、第10类和第12类病原菌均为链格孢菌。在此基础上，已着手开展病原菌回接试验和药剂筛选试验。

Isolation and Identification of Pathogens from Seed Lotus

LUO Yinhua1,LIU Bo2,ZHU Yujing2,XIAO Rongfeng2,YANG Yingying2,YANG Shengchun1
(1.Jianning Research Institute of Lotus Seeds,Fujian 354500;2.Agricultural Bio-resources Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences)

Endophytes were isolated from 12 types of disease-infected tissues of seed lotus,and their total DNA were extracted as PCR templates.The PCR products were sequenced and analyzed for identification.The results showed that none endophyte was obtained from the 8th type sample among the 12 type samples of seed lotus.The 5th and 11th type samples were infected by bacterial infection,and the rest were induced by fungal infection.The pathogen of the 1st type sample was identified asEpicoccum nigrum,while pathogens of the 2nd and 3rd type samples wereFusarium orobanches, the pathogen of the 4th type sample wasPhomopsis mcrosporKoby&Chib,and the pathogens of the rest samples wereAlternariaspp..

Seed lotus;Pathogens;Isolation;Identification