茄子组织培养高效再生植株体系的优化

黄志银，曹必好

（1.天津科润蔬菜研究所，300384；2.华南农业大学园艺学院）

茄子组织培养高效再生植株体系的优化

黄志银1，曹必好2

（1.天津科润蔬菜研究所，300384；2.华南农业大学园艺学院）

以三月茄为试验材料，探讨了不同浓度6-BA、ZT与IAA对茄子外植体不定芽分化的影响，比较了下胚轴不同接种方式对不定芽分化的影响和不同生根培养基对茄子不定芽的生根效果。结果表明，MS＋IAA（0.2 mg/L）＋6-BA（2.0 mg/L）＋ZT（1.0 mg/L）能加强外植体不定芽的分化能力，带柄子叶的不定芽分化率达到60.2%，下胚轴的不定芽分化率达到98.1%，类Flamingo-bill外植体的不定芽分化率更是达到了100%；与横向平接相比，下胚轴正向扦插能提高不定芽的分化率和不定芽分化系数，还能提前分化；茄子不定芽在MS固体培养基上生根效果最好，生根率达到100%。

茄子；外植体；再生；分化系数

利用转基因技术将外源目的基因导入茄子（Solanum melongenaL.），为茄子育种创造新的种质资源，是茄子分子育种的重要途径之一。实现外源基因的成功转化的前提是建立一个茄子高效再生体系。有关茄子离体再生的研究，在国内外有过一些报道，研究者从茄子的器官分化[1～7]、胚状体诱导[8，9]、花药培养[10]、小孢子培养[11，12]、原生质体培养[13～15]等方面进行了研究，不同研究者得到的结果不一样。虽然取得了一些成就，但不定芽分化频率还是不高，仍然不能满足茄子遗传转化的要求。本文以三月茄为试材，探讨了影响茄子离体培养的主要因素，以期建立适用于茄子遗传转化的高效再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为三月茄，购自重庆市农业科学院重庆科光种苗有限公司。

1.2 试验方法

①无菌苗的获得 将三月茄种子经单蒸水浸泡1 h左右，并冲洗3～5次。在超净工作台上，用75%的酒精消毒0.5～1 min，接着用无菌水清洗2～3次，再用含2%有效氯的次氯酸钠溶液浸泡消毒20 min，无菌水清洗2次后用适量无菌水浸泡种子5～8 min，最后用无菌水清洗2～3次后播种在含有0.7%琼脂和3.0%蔗糖的1/2 MS固体培养基上。接种后在 （25±1）℃和16 h光照/8 h黑暗的条件下培养，2周左右得到待用的无菌苗。

②分化培养基配方 在加有0.8%琼脂和3.0%蔗糖的MS培养基中，添加不同浓度的6-BA、IAA和玉米素（ZT），各种培养基配方见表1。

③外植体的制备及接种 将12～14 d苗龄的三月茄无菌苗，在超净工作台上切成3种类型的外植体（带柄子叶、下胚轴、类Flamingo-bill——不含生长点的子叶带下胚轴），带柄子叶去掉部分叶尖造成伤口，下胚轴切成1 cm左右长的小段，类Flamingo-bill外植体的下胚轴保留1 cm左右长度，3种类型外植体分别接种在含有不同植物生长调节物质的分化培养基上。

带柄子叶平放接种，类Flamingo-bill外植体采用3种扦插方式接种，一部分下胚轴以正向扦插的方式接种在分化培养基上，一部分下胚轴反向扦插接种，一部分下胚轴以平放的方式接种，每种外植体每个处理接种36个外植体，3次重复。接种后置于培养室，在（25±1）℃和16 h光照/8 h黑暗的光周期下培养，光强1 600～2 000 lx；每3 d观察一次，记录各类外植体的分化情况；每2周继代一次，4周后分别统计不同接种方式的3种外植体的愈伤率、不定芽分化率和不定芽分化系数。愈伤率（%）=（愈伤数/接种的外植体总数）×100%；不定芽分化率（%）=（分化不定芽的外植体数/接种的外植体总数）× 100%；不定芽分化系数=分化的不定芽总数/分化的外植体总数。

表1 不同分化培养基配方

④不定芽生根及移栽 待分化的不定芽伸长至2～3 cm，长出2片以上真叶时，将其转接到4种加有0.8%琼脂和3.0%蔗糖的不同生根培养基[MS，MS＋IAA（0.1 mg/L），MS＋IAA（0.2 mg/L），MS＋NAA（1 mg/L）]上生根，待小植株根系发达后，进行驯化移栽。在人工气候培养箱中将封口膜打开，炼苗3 d。然后取出小植株，小心洗净根部培养基，移栽到土壤透气性好的花盆中，并覆盖塑料薄膜，每天对叶片喷雾3次，以保持湿度，待新叶长出后，去掉薄膜。将炼苗移栽到大田，2周后统计组培苗的移栽成活率。

2 结果与分析

2.1 不同生长调节物质对三月茄愈伤产生和不定芽分化的影响

从表2可以看出，6-BA对三月茄的不定芽分化效果较好，3种类型外植体的平均不定芽分化率达到40%以上，最高达到88.9%。但是在试验中观察到，当加入较高浓度6-BA后，外植体愈伤组织形成较多，一定程度上抑制了不定芽的分化和伸长；当加有低浓度的IAA后，不定芽的分化率明显提高，平均达到了60%以上，最高达到100%。玉米素（ZT）对三月茄的不定芽分化效果也较理想，0.5～2 mg/L的ZT可使不定芽分化率平均达到70%以上，最高的达到100%。同样玉米素浓度过高也会使外植体大量产生愈伤组织，不利于不定芽的分化。当把6-BA、IAA和ZT都加入培养基时（B17），不定芽的分化率明显提高，平均可达86.1%，最高达到100%。 3种外植体均在培养基B17上的分化效果最好，下胚轴和类Flamingo-bill外植体的不定芽分化率及不定芽分化系数分别达到了98.1%、3.2和100%、1.8；对于带柄子叶来说，不定芽分化率也达到了60.2%，但是其不定芽的分化系数不如在B5和B8上高，只有1.4。

表2 不同培养基对不同外植体类型不定芽分化的影响

2.2 不同类型外植体不定芽分化的比较

试验中观察到（表2），平放接种的下胚轴和带柄子叶分化不定芽的方式为先脱分化产生愈伤组织，再从愈伤上分化出不定芽；扦插接种的下胚轴和类Flamingo-bill外植体主要从顶端的伤口处直接分化出不定芽，插入培养基的部分则产生愈伤组织，有的愈伤能分化出胚状体，但难以形成正常的不定芽。带柄子叶不如另外2种外植体的不定芽分化效果好，分化率显著偏低。在试验中比较了不同外植体的不定芽分化系数，下胚轴的不定芽分化系数比另外两种外植体的高，大多数都可以分化出两个以上的不定芽；而类Flamingo-bill外植体大多数都产生1个不定芽，带柄子叶基本上也是从叶柄部位分化出1个不定芽。

2.3 不同接种方式对茄子下胚轴愈伤发生及不定芽分化的比较

试验观察到茄子下胚轴横向平接不定芽分化效果不如正向扦插接好，不定芽分化系数也没有正向扦插的高。如表3所示，以横向平接的方式接种下胚轴的不定芽分化率只有43%，不定芽分化系数平均为1.8，而以正向扦插接种的分别达到98%和 2.6。试验中发现横向平接的下胚轴愈伤分化能力强，产生大量白色疏松愈伤，且发现横向平接的下胚轴只在其植物学上端发生不定芽分化，其周围的愈伤组织不能分化成芽，而正向扦插的下胚轴则从上端直接分化出不定芽，下端仍能分化愈伤组织，且愈伤组织较紧实，绿色芽点较多，比横向平接的下胚轴容易分化出不定芽，分化时间也要早2 d左右。这表明，正向扦插接种能明显提高不定芽的分化能力和使其提前分化。但是，在试验中观察到，如果反向扦插接种，则下胚轴只产生愈伤组织，基本没有不定芽的分化。

2.4 不同生根培养基对不定芽生根的影响

如表4所示，不加任何植物生长调节物质的MS培养基对茄子的生根效果最好，生根率达100%，每个不定芽产生的主根数量平均达到4.6条，而且有许多侧根，炼苗移栽全部成活；加有0.1，0.2 mg/L IAA的配方生根效果也较好，MS+IAA（0.1 mg/L）的配方生根率和移栽成活率都达到100%；当IAA浓度达到0.2 mg/L时，主根变得粗大，主根数量较少，组培苗移栽成活率也降低。试验中观察到当加有IAA或者NAA时不定芽的生根基部有愈伤产生，尤其是加有1 mg/L的NAA时不定芽基部产生大量的愈伤组织，不利于根的分化，分化的主根和侧根都很少，不利于组培苗移栽成活。

3 结论与讨论

6-BA和ZT是组织培养中广泛应用的生长调节物质，尤其是6-BA在茄科植物[7，10]中应用有良好的效果，当6-BA难于诱导分化时，改用或者添加ZT有较好的效果；IAA则能促进细胞的伸长和分化。本研究在分化培养基B17上，将茄子下胚轴正向扦插接种，不定芽分化率达到98.1%，分化系数达到3.2，而横向平接的下胚轴不定芽分化率只有43%，分化系数为1.8；类Flamingo-bill外植体的不定芽分化率可达到100%，带柄子叶的达到60.2%。而同类研究报道当中，俞琼等[5]得到的茄子子叶不定芽分化率最高为37.0%，下胚轴的最高为46%；余波澜等[4]得到的最高茄子子叶和下胚轴不定芽分化率分别为37%和67%；张兴国等[3]报道的三月茄下胚轴最高不定芽分化率也才达78.8%，这说明本研究得到的三月茄不定芽分化效果较好，主要原因为培养基配方差异和接种方式，因为同类报道都是将下胚轴平放接种在分化培养基上，先脱分化后再分化不定芽，而本研究则以茄子下胚轴正向扦插的方式接种，不定芽的发生大多数是直接从伤口处分化；并且与横向平接相比，正向扦插接种除不定芽分化率高外，分化时间还可以提前2 d左右，不定芽的伸长也很容易。

表3 下胚轴不同接种方式对不定芽发生的比较

表4 不同配方生根培养基对三月茄生根效果的比较

本研究同样观察到不定芽呈极性分化的现象，结果和余波澜等[4]的研究相似。不同的是，当下胚轴正向扦插接种时也能得到第3种类型[4]的愈伤组织，且能观察到不定芽从愈伤组织上分化出来，但是大部分玻璃化，较难长成正常的不定芽。当下胚轴正向扦插接种时，如果植物学上端插入培养基，则植物学上端部分分化坚实的深绿色愈伤组织，难以形成不定芽，而其植物学下端则在空中产生一个白色泡状愈伤，但愈伤不会疯长，也不会分化芽，有的能观察到根分化。这表明，茄子下胚轴分化不定芽存在极性分化现象，且正向扦插接种利于极性分化的表现，能明显提高不定芽的分化能力和提前分化。本研究认为极性分化发生可能与子叶柄和下胚轴的近子叶端的分生活跃细胞容易脱分化和再分化有关[4]，还可能与植物激素的极性运输有关，外植体自身产生的激素及其控制的浓度可能更利于不定芽的分化。我们得到的茄子高效再生体系是否具有通用性，还有待进一步的验证。

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Optimization of Efficient Regeneration System of Eggplant in Vitro

HUANG Zhiyin1,CAO Bihao2
(1.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute,300384;2.College of Horticulture,South China Agricultural University)

Taking the explants of Sanyueqie as materials,we studied the effects of different concentrations of 6-BA,ZT and IAA mixture on the differentiation of adventitious buds,compared the effects of different inoculated ways of hypocotyls on adventitious bud differentiation and rooting efficiency of different rooting medium on adventitious buds.The results showed that the medium[MS+IAA(0.2 mg/L)+6-BA(2.0 mg/L)+ZT(1.0 mg/L)]could improve the differentiation ability of adventitious buds,and the adventitious bud differentiation rates of cotyledons with petiole,hypocotyls and hypocotyls with a cotyledon were 60.2%,98.1%and 100%respectively.Compared to the parallel inoculation,the normal vertical inoculation was better,with both the bud differentiation rate and bud differentiation coefficient increased and the differentiation time reduced.The solid MS medium possessed the best rooting effect,with the rooting ratio of 100%.

Eggplant;Explant;Regeneration;Differentiation coefficient

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.10.002

广东省科技攻关项目（2007A020300009-4）；华南农业大学校长基金；天津市农业科学院院长基金

黄志银（1982-），男，硕士，助研，从事不结球白菜（油菜）育种研究，电话：13512469223，E-mail：falcon_888@163.com

曹必好，通信作者，电话：020-85280028，E-mail：caobh01@163.com

2012-03-13