miRNA指纹图谱及其在结直肠癌个体化治疗中的应用

马一杰，陈小兵，罗素霞

河南省肿瘤医院肿瘤内科，河南郑州 450008

miRNA指纹图谱及其在结直肠癌个体化治疗中的应用

马一杰，陈小兵，罗素霞

河南省肿瘤医院肿瘤内科，河南郑州 450008

目的结直肠癌为常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。由于个体差异的存在，对不同个体采用相同的治疗方案不仅造成医疗资源的浪费，而且可能给患者带来伤害。近年来，疗效和个体差异的关系越来越受到医学工作者的重视，个体化治疗成为临床治疗及基础研究必然趋势。分子生物学及其技术在疾病的诊断及个体化治疗方面的重要性日益显现。microRNAs(miRNAs)是一类非编码小分子RNA，其表达谱的变化与结直肠癌的发生、发展具有明确的相关性。因此，特定miRNA表达谱可能构成识别结直肠癌与其他疾病的"指纹"，用于诊断、预后判断、疗效预测等领域，指导结直肠癌诊断及个体化治疗。

miRNA;结直肠癌;个体化治疗

大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，随着医学水平的不断提高，结直肠癌早期诊断和治疗手段不断创新。然而，临床工作中发现，即使相同病理类型、分期及接受相同治疗方案的不同患者，其疗效及不良反应仍具有很大的差异，这种差异有时甚至是致命的。因此，个体化治疗是现代医学的发展方向和必然趋势。miRNA作为新的切入点，为结直肠癌个体化治疗开辟了新的途径。

1 miRNA指纹图谱技术进展

近年来，miRNA成为研究热点，其光芒盖过siRNA、mRNA，成为分子生物学领域闪耀的明星。它广泛参与细胞增殖、发育、分化、凋亡等各个进程，与肿瘤发生发展密切相关。有趣的是，miRNA“戏路颇广”，有时扮演正面人物-肿瘤抑制基因，有时也会饰演大反派-癌基因。对于如此极具潜力的标志物候选者，研究者当然不会视而不见。由于对miRNA表达谱的分析是临床应用的基石，其检测技术手段在生命科学工作者的努力下也是日新月异，不断提高创新。

1.1 Northern杂交 首当其冲的，Northern杂交是一种简便可靠的检测方法［1］。它不仅能够用于组织细胞中 miRNA表达水平的检测，而且可以通过结合RNA marker，经凝胶电泳检测其分子大小。但是，Northern杂交的缺点在于可能出现假阴性，对样品的需求量相对较高，有时甚至要达到40 μg的样品量才能出现明显杂交信号。

1.2 原位杂交 原位杂交是指以特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行，能够更直观的展示出miRNA的时空表达模式。此外，该技术不但能够定量分析单个细胞中miRNA的表达，还能够在未经分类及分离的情况下，比较miRNA在不同细胞株中的表达水平。

1.3 基因芯片 高通量检验测定miRNA的平台当属基因芯片，它能同时勘测成百上千个 miRNA的表达［2］。芯片应用大规模微阵列技术，将数千探针整合于一张芯片，筛选速度和通量得到了很大提高，成为广大研究者的首选方案。该技术在众多研究中被采用，藉此建立了不同物种组织miRNA表达谱，同时也被广泛应用于病变组织和正常组织miRNA表达谱差异鉴定。

1.4 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)RT-PCR是一种半定量或定量检测miRNA表达的实验技术，在miRNA表达的研究过程中得到不断改进。该技术的优势在于:可在短时间内高通量检测多种miRNA表达;较之 Northern杂交不需要放射性同位素标记，且RNA需求量较小;能够同时对成熟miRNA及前体miRNA进行检测;操作简便。

2 miRNA指纹图谱与结直肠癌个体化治疗

2.1 miRNA指纹图谱在结直肠癌靶向治疗中的应用

miRNA通过参与调控一些细胞生命活动关键信号通路相关蛋白，如 Wnt/β 粘连蛋白［3］及 PI3K 通路［4］、KRAS［5-6］、p53［7-8］、IGF 信号通路［9］、E2F 家族［10］、细胞外基质调控因子以及上皮-间质转化(EMT)转录因子等［11-12］，组成强大的基因网络，它们极有潜力成为结直肠癌治疗靶点和强大的干预工具。

相关研究显示，抑制miR-21和miR-17-92活性能够减少肿瘤生长、血管生成、侵袭和转移［13-14］。这些miRNA在结直肠癌中充当癌基因或抑癌基因，且可能成为miRNA靶向治疗候选分子。靶向这些miRNA不仅能够阻止UICCⅡ期高危疾病的复发，还可以控制进展期转移性肿瘤的生长。调控抑癌或促癌基因的基因治疗可以用来治疗结直肠癌并阻断损害的进展。这种调控能控制肿瘤生长率且极有潜力成为早期或进展期肿瘤崭新的治疗手段［15-16］。但是，它们也可能诱导放化疗耐药的发生。尽管试验性miRNA治疗看起来很有前景，但是只有数量有限的研究进行了动物模型的体内试验。未来第一个临床miRNA靶向疗法的开发任重而道远。

2.2 miRNA指纹图谱技术在结直肠癌化疗中的应用

个体化治疗的另一个关键部分在于化疗疗效预测。Nakajima等［17］对接受S-1(基于5-FU的抗代谢药物)治疗的结直肠癌患者肿瘤组织中5种成熟miRNA进行评估，发现let-7g和miR-181b可作为S-1为基础的化疗应答预测因子。Borralho等［18］以结肠癌细胞株HCT116为模型，探讨miR-143对在化疗敏感性方面的生物学作用。研究显示，一过性miR-143过表达可导致约60%的细胞减少。此外，该研究小组用G418筛选稳定过表达miR-143的细胞并用5-FU进行处理，结果显示，稳定过表达miR-143的细胞经5-FU处理后活性下降且凋亡增加，且这些变化均伴随核碎裂的增加和 caspase-3，-8，-9 激活。Boni等［19］在61 例接受5-FU和伊立替康(CPT-11)治疗的转移性结直肠癌患者中，对18种miRNA基因所在区域 (原始miRNA和miRNA前体)及miRNA合成相关基因的多态性与临床特征的关系进行研究。结果显示，pri-miR-26a-1 SNP rs7372209与肿瘤应答和疾病进展时间 (TTP)相关(P值分别为0.041和 0.017)。基因型CC、CT较TT相比具有更好的预后。SNP rs1834306，位于pri-miR-100基因上，显示出较长的TTP(P=0.04)。在miRNA的生物合成途径方面，输出蛋白-5基因 SNP rs11077与疾病控制率之间具有相关趋势(P=0.076)。

2.3 miRNA指纹图谱在结直肠癌预后评估中应用

既有证据显示miRNA表达模式对已确诊的肿瘤是独一无二的，且极具潜力成为临床预后因子。Chen等［20］发现结直肠癌组织miR-148a和miR-152表达水平与配对癌旁组织相比显著降低(P＜0.001)。进一步研究发现，miR-152、miR-148a的表达水平与肿瘤大小(P值分别为0.004和0.018)及病理T分期 (P值分别为0.002和0.023)负相关。

MiR-21在包括结直肠癌在内的很多实体瘤中表达上调，且其过表达与已知预后因子如N分期，疾病转移和UICC 分期等密切相关［21］。Kulda 等［22］研究发现，miR-21和miR-143表达水平与无病生存期(DFI)相关(P值分别为0.0026和0.0191)。MiR-21高表达的患者DFI较短。令人惊讶的是，肿瘤抑制基因miR-143高表达者也表现出较短的DFI。通过对比分析，Schetter等［23］发现37种不同miRNA在结直肠癌患者肿瘤组织中异常表达。其中，miR-20a，miR-21，miR-106a，miR-181b，和miR-203在COX回归分析中显示出较差的生存。该研究组在验证试验中用RT-PCR法检测肿瘤及配对非肿瘤组织中miRNA表达情况，结果显示，只有miR-21过表达与较差的预后显著相关，而与年龄、性别和肿瘤位置无关。多元分析进一步显示肿瘤中miR-21高表达与较差的生存有关，且独立于肿瘤分期之外。Schepeler等［24］发现miRNA和Ⅱ期结肠癌微卫星稳定性有关，基于miRNA表达谱的标记物预测疾病复发的总体准确度高达81%，因此，miRNA在判断肿瘤侵袭能力方面极具应用潜力。Kaplan-Meier生存曲线显示，高表达miR-320或miR-498的Ⅱ期结直肠癌患者无进展生存期(PFS)与低表达患者相比显著缩短。这些miRNA与PFS的关系也在多元分析中得到验证。

3 展望

检测技术日新月异的同时，仍然存在一定的局限性。因此，我们需要综合运用现有技术手段的同时加快miRNA表达谱研究技术的开发和改进，进一步提高其敏感性、特异性、稳定性以及可重复性。

miRNA指纹图谱为结直肠癌临床个体化治疗提供新思路，如何结合临床需求利用miRNA指纹图谱技术指导临床决策具有探索性。相信在不久的将来，随着分子生物学研究的深入和试验技术的完善，miRNA必将在结直肠癌的发病机制研究和个体化治疗中发挥更大的作用，带来未来临床医学上的变革。

［1］ Sempere LF，Freemantle S，Pitha-Rowe I，et al.Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronal differentiation［J］.Genome Biol，2004，5(3):R13.

［2］ Krichevsky AM，King KS，Donahue CP，et al.A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development［J］.RNA，2003，9(10):1274-1281.

［3］ Nagel R，le Sage C，Diosdado B，et al.Regulation of the adenomatous polyposis coli gene by the miR-135 family in colorectal cancer［J］.Cancer Res，2008，68(14):5795-5802.

［4］ Guo C，Sah JF，Beard L，et al.The noncoding RNA，miR-126，suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers［J］.Genes Chromosomes Cancer，2008，47(11):939-946.

［5］ Webster RJ，Giles KM，Price KJ.Regulation of epidermal growth factor receptor signaling in human cancer cells by microRNA-7 ［J］.J Biol Chem，2009，284(9):5731-5741.

［6］Tsang WP，Kwok TT.The miR-18a*microRNA functions as a potential tumor suppressor by targeting on K-Ras［J］.Carcinogenesis，2009，30(6):953-959.

［7］ Hermeking H.p53 enters the microRNA world［J］.Cancer Cell，2007，12(5):414-418.

［8］ Yamakuchi M，Ferlito M，Lowenstein CJ.MiR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(36):13421-13426.

［9］ La Rocca G，Badin M，Shi B，et al.Mechanism of growth inhibition by microRNA 145:the role of the IGF-I receptor signaling pathway［J］.J Cell Physiol，2009，220(2):485-491.

［10］ Woods K，Thomson JM，Hammond SM.Direct regulation of an oncogenic micro-RNA cluster by E2F transcription factors［J］.J Biol Chem，2007，282(4):2130-2134.

［11］ Fearon ER，Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesis［J］.Cell，1990，61(5):759-767.

［12］ Hu G，Chen D，Li XM，et al.MiR-133b regulates the MET proto-oncogene and inhibits the growth of colorectal cancer cells in vitro and in vivo［J］.Cancer Biol Ther，2010，10(2):190-197.

［13］ Krichevsky AM，Gabriely G.MiR-21:a small multi-faceted RNA［J］.J Cell Mol Med，2009，13(1):39-53.

［14］ Dews M，Homayouni A，Yu D，et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNA cluster［J］.Nat Genet，2006，38(9):1060-1065.

［15］ Calin GA，Croce CM.Chromosomal rearrangements and microRNAs:a new cancer link with clinical implications［J］.J Clin Invest，2007，117(8):2059-2066.

［16］ Tong AW，Nemunaitis J.Modulation of miRNA activity in human cancer:a new paradigm for cancer gene therapy?［J］.Cancer Gene T-her，2008，15(6):341-355.

［17］ Nakajima G，Hayashi K，Xi Y，et al.Non-coding MicroRNAs hsalet-7g and hsa-miR-181b are Associated with Chemoresponse to S-1 in Colon Cancer［J］.Cancer Genomics Proteomics，2006，3(5):317-324.

［18］ Borralho PM，Kren BT，Castro RE，et al.MicroRNA-143 reduces viability and increases sensitivity to 5-fluorouracil in HCT116 human colorectal cancer cells［J］.FEBS J，2009，276(22):6689-6700.

［19］ Boni V，Zarate R，Villa JC，et al.Role of primary miRNA polymorphic variants in metastatic colon cancer patients treated with 5-fluorouracil and irinotecan［J］.Pharmacogenomics J，2011，11(6):429-436.

［20］ Chen Y，Song Y，Wang Z，et al.Altered expression of MiR-148a and MiR-152 in gastrointestinal cancers and its clinical significance［J］.J Gastrointest Surg，2010，14(7):1170-1179.

［21］ Slaby O，Svoboda M，Fabian P，et al.Altered expression of miR-21，miR-31，miR-143 and miR-145 is related to clinicopathologic features of colorectal cancer［J］.Oncology，2007，72(5-6):397-402.

［22］ Kulda V，Pesta M，Topolcan O，et al.Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases［J］.Cancer Genet Cytogenet，2010，200(2):154-160.

［23］ Schetter AJ，Leung SY，Sohn JJ，et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma［J］.JAMA，2008，299(4):425-436.

［24］ Schepeler T，Reinert JT，Ostenfeld MS，et al.Diagnostic and prognostic microRNAs in stage II colon cancer［J］.Cancer Res，2008，68(15):6416-6424.

MicroRNA fingerprint in colorectal cancer and its application in individual therapy

MA Yijie，CHEN Xiaobing，LUO Suxia
Department of Oncology，Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China

Colorectal cancer is one of the most frequent malignant disease，it is still a very severe disease for people.Due to individual differences，the same treatment plan for different people would waste medical resources and even harm patients.The efficacy of the oncological treatment depends mainly on the features of the malignant tissue.During the last decade，the importance of the molecular biology and it’s methodology have been growing for both detection of the disease and the selection of the best treatment plan for individual patient.MicroRNAs(miRNAs)are short non-coding segments of RNA which are involved in colorectal cancer development.Thus，“fingerprint”consisted of miRNA expression patterns may contribute individual therapy by refine diagnosis，prognosis and therapeutic effect prediction.

miRNA;Colorectal cancer;Individual therapy

R735.3+4

A

1006－5709(2012)11－0994－03

2012-05-04

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.004

马一杰，硕士。E-mail:mayijie1987@126.com

陈小兵，E-mail:chenxiaobing@medmail.com.cn;罗素霞，E-mail:luosxrm@163.com

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