不同测定方法对青贮饲料中NDF和ADF含量的影响

王晓娜，徐春城，温定英，陶 雅，孙启忠，韩海波

(1.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.中国农业大学工学院，北京 100093; 4.内蒙古草原勘察规划院，内蒙古 呼和浩特 010051)

青贮饲料作为现代畜禽最主要的粗饲料来源，在畜牧业的发展中愈来愈受到养殖户的重视，畜禽日粮营养价值的高低与其纤维性物质含量高低密切相关[1-3]，按Van Soest[4]提出的洗涤纤维分析方法，饲料中的中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(Acid Detergent Fiber,ADF)可以替代传统的粗纤维，较准确地反映纤维的实际含量。根据薛红枫和孟庆翔[5]的分析，由于日粮中大部分NDF来源于饲草，粗饲料来源的NDF有效性平均相当于非粗饲料来源NDF的2倍，粗饲料的NDF对家畜生产性能的发挥至关重要。ADF虽然不能做为饲料纤维的评价指标，但是它为木质素的测定奠定了基础，与饲料营养物质的消化率有较强的相关关系，且在评价饲料有效能值的过程中使用广泛[6-8]。所以，准确快速地测定青贮饲料中NDF和ADF含量对于青贮饲料质量评价和畜牧业的发展起着举足轻重的作用。

目前，国际上普遍采用Van Soest饲草分析法，其中，ADF的分析方法已被AOAC收录(AOAC973.18)，但Van Soest法测定NDF的方法未被AOAC收录[9]，这主要由于在测定NDF时，中性洗涤剂提取淀粉不彻底，尚有一定数量淀粉残留在洗涤后的残渣中，降低了NDF的准确性[10]。但通过在洗涤剂中添加一定量的耐高温α-淀粉酶，可使这个问题得以解决[11-12]，因为耐高温α-淀粉酶是一种内切淀粉酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的α-1，4淀粉葡萄糖糖苷键，酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速降低，变成液化淀粉，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖，进而增加饲料中NDF 测定结果的准确性。目前，实验室一般采用范氏洗涤法对饲料中的ADF进行测定，此种方法在测定时需要重新称取样品，测定过程中还需要保持滤器质量不变。习惯上认为，NDF相当于纤维素、半纤维素和木质素，而ADF则相当于纤维素和木质素[13]，由于NDF和ADF仅相差一种物质，所以可以考虑采用连续洗涤法对青贮饲料的ADF进行测定，这样不仅减少了实验的繁琐步骤，而且有效提高测定的效率。对于粗饲料ADF的测定，国内大部分研究均采用传统的范氏洗涤法[14-17]，薛红枫和孟庆翔[12]在试验中使用连续洗涤法对粗饲料ADF进行测定，并证明了此法的可行性。国内对饲料中NDF和ADF测定过程中所使用的滤器做了大量的研究，实验室一般使用的热抽滤装置主要有玻璃坩埚、ANKOM滤袋、CAU滤袋等[18-20]。

为了准确快速有效地评价青贮饲料纤维价值，本研究采用酶处理法测定不同青贮饲料的NDF，连续洗涤法测定ADF含量，并就3种滤器对青贮饲料NDF和ADF的影响进行比较，以期为测定青贮饲料NDF和ADF含量提供可行性依据。

1 材料与方法

1.1样品的选取与制备 选取采集自内蒙古的8种不同青贮饲料，分别为全株玉米(Zeamays)青贮、干玉米秸青贮、青玉米秸青贮、甜菜(Betavulgaris)青贮、苜蓿(Medicagostiva)青贮、直穗鹅观草(Roegneriaturzaninovii)青贮、尖叶胡枝子(Lespedezahedysaroides)青贮和全混合日粮(Total Mixed Ration,TMR)青贮(组成TMR日粮后青贮)。对青贮样品采用四分法，缩分至200 g，粉碎后过0.425 mm分析筛，样品待用。

1.2仪器与试剂 本试验选取的滤器为玻璃坩埚 (型号为P2，砂芯孔径40～60 μm)、ANKOM F57(30 μm)滤袋、CAU(20 μm)滤袋以及配套的封口机，纤维半自动测定仪，烧杯，FOSS纤维测定仪。

耐高温α-淀粉酶(α-Amylase,heat-stable)由美国Sigma公司提供，型号为A3306，推荐用量为每样品0.1 mL。

中性洗涤剂：称取18.61 g乙二胺四乙酸二钠(EDTA，化学纯)和6.81 g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)同时放入1 000 mL烧杯中，加少量水加热溶解后，再加30 g十二烷基硫酸钠和10 mL乙二醇乙醚。称取4.65 g无水磷酸氢二钠，放在另一烧杯中，加少量水，微微加热溶解后倾入第1个烧杯中，稀释至1 000 mL，此溶液pH值范围为6.9～7.0。

酸性洗涤剂：称取20 g十六烷基三甲基溴化铵，溶于1 000 mL已标定过的0.5 mol·L-1硫酸溶液中，搅动溶解。

1.3实验步骤

NDF测定：称取1 g(准确到1/10 000 g)样品装入已恒重的ANKOM F57滤袋、CAU滤袋中，封紧袋口，每个样品设3个重复，每种滤袋设3个空白，将空白组和处理组分别放入3 000 mL的烧杯，每个烧杯放20个滤袋，按每个滤袋100 mL中性洗涤剂和0.5 g无水亚硫酸钠加入烧杯，处理组每样另外加入100 μL耐高温α-淀粉酶。将置有冰袋的蒸发皿放在烧杯上口，将烧杯置于电热板上，在5～10 min内煮沸，并持续保持微沸1 h。在整个煮沸过程中，每隔10 min用玻璃棒轻轻搅动并在烧杯壁上挤出各滤袋内的溶液，以保证中性洗涤剂充分作用于袋内样品。煮沸完毕后，离火冷却10 min，用玻璃棒将滤袋夹出并放入另一烧杯，倒掉废液。然后用沸水少量多次反复洗涤,在洗涤过程中，要用玻璃棒挤压滤袋，以使洗涤完全。并用pH试纸检测，直至滤液显示为中性，挤干余水，用20 mL(20 mL·袋-1)丙酮冲洗2次，挤干袋内丙酮，置于105 ℃的烘箱中烘3 h，然后取出放入干燥器中冷却30 min，称量，直至质量不变，并记录数据。P2型玻璃坩埚按照FOSS仪仪器说明测定青贮饲料中NDF含量。

ADF测定：对照组按范氏洗涤法步骤进行，即与NDF对照组的测定步骤相同，只是不添加无水亚硫酸钠。处理组按Goering和Van Soest[21]的连续洗涤法对不同青贮饲料中ADF的含量进行测定，即用装有NDF残渣的3种滤器继续进行酸性洗涤处理。

1.4数据分析 采用SAS学生版8.0软件中的ANOVA程序对数据进行方差分析和多重比较。

2 结果

2.1洗涤剂对3种滤器质量的影响 各种滤器直接经中性洗涤剂和酸性洗涤剂处理后，质量虽有增减，但是变化幅度很小(表1)，平均失重率的绝对值都小于1%。经过添加耐高温α-淀粉酶的中性洗涤剂以及连续洗涤法对3种滤器做空白处理后，3种滤器质量均未受到显著影响。因此，使用3种滤器测定青贮饲料中NDF和ADF时，可以不考虑滤器质量的变化对结果产生的影响。

2.2耐高温α-淀粉酶对青贮饲料NDF含量的影响 与对照所测青贮饲料NDF结果相比，在中性洗涤剂中添加耐高温α-淀粉酶对不同种类青贮饲料的NDF影响不同，但是大都存在减小的趋势，其中全株玉米青贮和TMR青贮饲料在添加耐高温α-淀粉酶后NDF含量显著减小(P<0.05)，尤以TMR青贮饲料变化最为显著(表2)；耐高温α-淀粉酶对其他青贮饲料的NDF含量无显著影响；滤袋与淀粉酶之间对青贮饲料NDF含量的测定无显著的交互作用(P<0.05)。

表1 洗涤剂对滤器质量的影响

2.3不同滤器对青贮饲料NDF含量的影响 在中性洗涤剂中添加耐高温α-淀粉酶后，不同青贮饲料经过3种滤器测得的NDF结果差异情况不同，但是，与其他2种滤袋相比，通过P2型玻璃坩埚进行热抽滤所测得的结果均存在增高的趋势，尤其以TMR青贮饲料表现最为显著(P<0.05)；其他7种青贮饲料经3种滤器测得的结果相差不显著；8种青贮饲料经过ANKOM滤袋和CAU滤袋所得NDF值均无显著差异(表2)。

2.4连续洗涤法对青贮饲料ADF测定结果的影响 与范氏洗涤法相比，连续洗涤法对ADF测定结果的影响因青贮种类不同而存在差异。除P2型玻璃坩埚测定全株玉米青贮饲料和TMR青贮饲料的ADF外，经过连续洗涤法测定的ADF均存在减小的趋势，与对照相比，苜蓿青贮饲料和尖叶胡枝子青贮饲料的ADF含量变化较为显著(P<0.05)(表3)。连续洗涤法在测定全株玉米青贮饲料和TMR青贮饲料ADF时，实验未能完全消除P2型玻璃坩埚对NDF测定结果的影响，导致P2型玻璃坩埚测定的ADF结果显著高于对照(P<0.05)，其他种类青贮饲料的ADF无显著变化。在使用连续洗涤法测定ADF时，此法与滤器无显著交互作用(P>0.05)，连续洗涤法与青贮种类以及青贮种类与滤器均存在显著交互作用(P<0.05)。

表2 酶处理对不同滤器中青贮饲料NDF含量的影响

表3 连续洗涤法对青贮饲料ADF含量的影响

2.5不同滤器对青贮饲料ADF的影响 使用3种不同滤器测定不同青贮饲料NDF后，继续进行酸性洗涤处理。由于测定NDF时各种滤器孔径存在不同的阻塞，全株玉米青贮饲料和TMR青贮饲料经P2玻璃坩埚进行热抽滤后所测得的ADF值显著(P<0.05)高于其他2种滤器的测定结果，其他种类青贮饲料经3种滤器所测结果均无显著差异(表3)。

3 讨论

3.1酶处理对青贮饲料NDF的影响 本研究表明，测定不同青贮饲料NDF含量时，在中性洗涤剂中添加耐高温α-淀粉酶，只对全株玉米青贮饲料和TMR青贮饲料产生显著影响，这主要由于全株玉米青贮饲料和TMR青贮饲料中高淀粉含量的玉米籽实所致。也有研究指出[11]，测定高淀粉含量玉米样品的NDF时，必须在洗涤剂中添加耐高温α-淀粉酶。NDF是对植物细胞壁或纤维成分的一种测量指标，所测得的NDF主要由不溶性的非淀粉多糖和木质素组成。在测定高淀粉青贮饲料的NDF时，有效地去除其中的淀粉，是保证实验结果准确性的必需步骤，只有在中性洗涤剂中添加耐高温α-淀粉酶才会显著地提高测定结果的准确性，而对于淀粉含量低的青贮饲料，添加耐高温α-淀粉酶则会增加测定成本[22]。隋连敏等[11]在测定玉米样品的NDF时，研究了酶量的确定，指出在分析高淀粉含量样品的NDF时，耐高温α-淀粉酶的适宜用量为每滤袋0.8～1.0 mL。本研究中使用的酶量与其相符，试验结果也说明青贮样中的淀粉得到了充分的水解，实验的准确性得到了提高。

3.2连续洗涤法对青贮饲料ADF的影响 本研究表明，与传统的范氏洗涤法相比，苜蓿青贮饲料和尖叶胡枝子青贮饲料经过连续洗涤法所测ADF含量显著减小；连续洗涤法测定全株玉米青贮饲料与TMR青贮饲料的ADF含量显著高于范氏洗涤法测定结果，这主要由于玻璃坩埚在测定这2种青贮饲料NDF时，高淀粉导致砂芯被堵，以致过滤困难，最终导致ADF结果偏高。薛红枫和孟庆翔[12]采用连续洗涤法对玉米青贮饲料ADF进行测定，但是未与传统的范氏洗涤法进行比较，很多学者对粗饲料中的ADF也做了大量研究[23-24]，但是采用的均是传统的洗涤法，所以连续洗涤法测定青贮饲料ADF含量的可行性还有待进一步的研究。

3.3滤器对青贮饲料NDF和ADF测定结果的影响 中性洗涤剂和酸性洗涤剂对各种滤器的质量影响不明显，因此在使用这几种滤器时，可以忽略滤器对测定结果的影响，这与魏时来等[16]的研究结果相同。ANKOM滤袋和CAU滤袋是由特殊材料所制成，可耐受强烈化学试剂，合理的孔径可以保证洗涤液的自由流通，从而滤器质量不受洗涤剂的影响[5,19]。本研究表明，3种滤器测得的青贮饲料NDF和ADF值无显著差异，但是使用P2型玻璃坩埚所测得的值却存在情况不同的增大趋势，尤其是在淀粉含量高的全株玉米青贮和TMR青贮饲料上体现最为明显，这主要是由于样品中含有大量的淀粉，玻璃砂锅孔径被堵所致。正如冯继华等[25]所述，由于待测样品中含有较多的树脂、蛋白质、多糖等物质，在抽滤分离的过程中这些细小的颗粒容易在玻璃砂芯滤板表面形成致密层，或者直接堵住滤板细孔，阻碍过滤过程，明显延长过滤时间，甚至难以过滤，导致测定失败。薛红枫和孟庆翔[12]比较了这3种滤器对饲料样品NDF和ADF测定结果的影响，发现ANKOM滤袋和CAU滤袋对饲料样品中NDF和ADF的测定结果的相似系数(R2)均为0.996，玻璃坩埚与其他2种滤袋的相似系数也很高，这主要是由于试验中所使用的玻璃坩埚型号以及试验样品与本研究不同，关于P2型玻璃坩埚在测定青贮饲料中NDF和ADF试验的可行性，仍需大量试验验证。

4 结论

ANKOM滤袋和CAU滤袋适用于内蒙古地区常见青贮饲料NDF和ADF含量的测定，对于淀粉含量高的青贮饲料，需要在测定过程中进行酶处理以提高测定的准确性，在使用玻璃坩埚测定高淀粉含量的青贮饲料时应谨慎对待。连续洗涤法对苜蓿青贮饲料和尖叶胡枝子青贮饲料的影响较为显著，对其他种类青贮饲料的ADF含量无显著的影响，其原因仍有待进一步研究探讨。

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