新疆高葶韭雄蕊开花动态特征与花粉育性研究

林辰壹，韩文娟，祁晨霞，叶 强

(新疆农业大学林学与园艺学院,新疆 乌鲁木齐 830052)

植物雌雄蕊开放过程中的形态变化特征与柱头可授性和花粉育性密切相关，是植物长期适应生态环境变化、保障自身在自然条件下繁殖成功的进化结果，对于异花授粉植物而言，花粉作为父本重要的基因流载体，与花粉育性一起决定了雄性亲本的遗传信息是否能够传递给下一代[1]。对于虫媒花，雄蕊开放中的形态和时空变化影响到传粉昆虫的访花频率和时间，最终影响花粉的成功传递。因此，雄蕊的形态特征变化和花粉育性一直是植物繁殖生物学研究的基本点和出发点，是分析植物与传粉者的关系、交配系统选择的前提，是植物开花生物学重要的组成部分[2]。

高葶韭(Alliumobliquum)在中国仅分布于新疆和布克赛尔、沙湾、伊宁等海拔1 200～2 000 m的山地草原和草甸带中[3]，国外分布于俄罗斯、哈萨克斯坦、蒙古等国[4]。高葶韭是新疆干旱半干旱特殊环境下难得的早春野生蔬菜植物资源，一直以来被采集食用[5-6],在国外是重要的观赏植物资源[7-8]，同时，高葶韭植物的乙醇溶液的提取物对Aspergillusniger、Botrytiscinerea、Fusariumoxysporumsp.gladioli、Penicilliumexpansum以及Sclerotiniasclerotiorum有很强的抑制作用，由于含有天然抑菌成分使其成为植物源性杀菌剂被重视[9]。研究新疆特殊地理环境条件下高葶韭与环境相适应的生殖生长特点，是摸清自然条件下高葶韭种质资源繁殖规律过程中要解决的首要问题。目前，国内外有关高葶韭雄蕊特征和花粉育性的研究尚未见报道。本研究观测高葶韭花期其雄蕊的开放动态，同时检测花粉活力和花粉萌发率变化规律，以期为实现有效保护利用和人工繁育奠定基础，为野生葱属植物资源繁育系统研究和种质资源开发利用提供理论和实践指导。

1 材料与方法

1.1高葶韭雄蕊开花动态特征的观察 高葶韭花期选择总苞开裂但小花尚未开裂的单花观察其开花动态。随机挂牌标记健康、长势均匀的、即将开花的20 个花蕾，每天观察一次直到单花开放后每隔2 h观察一次，记录花朵的开放进程，直到花药全部落去花被片闭合[10]。雄蕊特征观察包括花丝及花药两部分。每次观测时记录雄蕊数目、形状、颜色及雄蕊伸展的时空动态变化特征，同时，测定空气的温度和湿度。花丝长度测量时，选择盛花期完全开放、花丝完全伸长、空间分布均一的单花。用镊子从花丝基部将花丝取下并去除花药，立即用游标卡尺测量各个花丝长度。

1.2高葶韭花粉育性的测定 花粉育性一般用花粉活力和花粉萌发率衡量[11]。本研究采用5种不同的花粉活力的染色检验方法,即0.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)、四甲基偶氮唑(MTT)、联苯胺、醋酸洋红、碘-碘化钾以及离体萌发法[12-15]。

在田间采集完全伸出花被片还未散粉的、饱满的、健康的花药。将尚未散粉的花药置于PC管中，自然条件下阴干，待自然散粉后立即测定花粉活力。取新鲜花粉置于载玻片上，分别滴入溶液，用解剖针将其混合均匀后，盖上盖玻片置于25 ℃的恒温箱内培养，分别在显微镜下观察着色情况。0.5% TTC溶液染色时培养20～30 min，联苯胺染色时静置3～4 min，碘-碘化钾染色时培养20～30 min，醋酸洋红和MTT染色时静置1～2 min。以经过高温杀死后的无活力花粉的着色能力为对照[14]，比较后判断花粉活力的有无并确定具有活力花粉的颜色以及颜色变化规律。每个处理重复3次，每张片观察时随机选取5个视野进行观察，每视野不少于30粒花粉。用花粉的着色率表示花粉的活力，计算花粉活力百分率。

离体萌发法以质量分数1%的琼脂、质量分数5%的硼酸配以不同质量分数的蔗糖(分别为 0、5%、10%、15%、20%、25%、30%)。将新鲜的花粉置于载玻片上，先用胶头滴管将上述培养基滴到载玻片上，培养基凝固后，新鲜花粉均匀地涂抹到培养基上，把载玻片置于底盖内放一张滤纸加入少许蒸馏水的培养皿上，于25 ℃ 的恒温箱内培养4 h，在显微镜下观察并统计萌发数。观察花粉萌发情况，以花粉管伸长长度超过或等于花粉粒直径作为已发芽(萌发)的标准，由此确定高葶韭花粉适宜的培养基后，再测定花粉散粉后的育性变化特点。

2 结果

2.1高葶韭雄蕊的形态特征与开花动态 高葶韭为顶生的伞形花序，两性花，花期为5月中下旬。单花较小，具6枚绿色花被片，中脉较花被片颜色深，为深绿色；具6枚等长的雄蕊，雄蕊数量固定。有3个内轮花丝和3个外轮花丝，内外轮花丝基部合生并与花被片基部贴生0.1～0.2 cm。高葶韭平均花丝长度为0.87～1.02 cm(平均为0.94 cm)。船形的6枚花药分别以丁字形着生于白色的花丝上，花药呈纵缝状开裂，未散粉前呈黄色，散粉时呈淡黄色，散粉后呈深黄色。

高葶韭单花花被片展开到闭合，单花经过5个形态变化时期，即①花被片未展开，小花朵呈灯笼状；②花药开始伸出，花被片先端略展开，小花朵呈杯状；③花药完全伸出，花被片完全展开，小花朵呈碗状；④花被片开始闭合，小花朵略张口呈杯状；⑤花被片完全闭合，小花朵呈灯笼状。高葶韭单花花被片未开裂小花朵呈灯笼状时，6枚花药合抱在柱头上；高葶韭单花花被片一般在08:30-09:30(17～19 ℃，空气相对湿度30%～50%)展开，花被片先端略张口小花朵呈杯状时，花药开始伸出；花被片完全展开一般在09:30-11:30(20～22 ℃，空气相对湿度40%～50%)，花朵呈碗状时花药全部伸出花被片，这个过程中内轮的花丝花药依次伸出花被片，当内轮第2枚花药伸出时，外轮的第1枚花药伸出，内轮第3枚花药伸出之后，外轮剩余2枚花药几乎同时伸出，从第1枚花药开始散粉到第6枚花药全部散完粉一般需要10～12 h，最快的3～7 h，最长的12～24 h；单花开放至萎蔫全部过程历经4～5 d(图 1)。

花药散粉集中在11:30-19:30(22～30 ℃，空气相对湿度25%～40%)，单枚花药从散粉到完全散粉一般需要1.5～2 h，长可达2～5 h，散粉结束后的花药外壁呈桔色，花丝失水萎蔫。从第1枚花药伸出花被片到花药全部脱落一般需要4～5 d，此时，花被片完全闭合贴附在子房上。

高葶韭单花开放时内轮花被片先展开，内轮花丝最先开始伸长，内轮花药先伸出花被片，随后外轮花被片展开，外轮花药陆续伸出花被片后柱头开始伸长。

图1 高葶韭雄花开花动态

开花受环境的影响，晴天花被片展开较快，花丝伸长和柱头伸长较长，花药散粉较快，整个开花过程也将缩短。阴天或雨天花被片展开较慢，花丝伸长不明显，花药散粉少或散粉很慢，若连续几天温度较低，整个开花过程将会延长1～2 d。

2.2高葶韭的花粉育性

2.2.1高葶韭花粉的活力 经TTC法染色，有活力花粉为淡粉红色、粉红色至红色。基于花粉活力颜色由浅至深的变化，有活力的花粉可以分为弱、中、强3个级别，与对照相比没有活力或不育花粉为淡黄色。方差分析(表1)表明,2～6 h的着色率在88.9%～100%，无显著差异，此阶段表现出强的花粉活力；2～8 h的花粉萌发率大于50%。散粉6 h以后，花粉染色数量呈下降趋势，散粉24 h后的花粉着色率为24.1%，且都染为淡粉红色，花粉活力弱；48 h以后花粉着色率为1.4%。其余全部呈淡黄色，花粉已无活力。

经MTT染色，有活力的花粉呈粉红色、淡紫色至深紫色。基于花粉活力颜色由浅至深的变化，有活力的花粉可以分为弱、中、强3个级别，与对照相比没有活力或不育花粉呈淡黄色。方差分析(表1)表明,4～6 h的着色率在92.3%～93.7%，无显著差异，此阶段表现出强的花粉活力；0～10 h的花粉萌发率大于50%。散粉8 h以后，花粉染色数量呈下降趋势，散粉24～72 h的着色率无极显著差异，24 h后的花粉着色率为14.7%，48 h以后花粉着色率为1.5%，且都染为粉红色，表现出花粉活力弱。其余全部呈现淡黄色，花粉已无活力。

表1 高葶韭花粉活力与花粉萌发率

经联苯胺染色，有活力的花粉呈淡粉红色、粉红色至红色。基于花粉活力颜色由浅至深的变化，有活力的花粉可以分为弱、中、强3个级别，与对照相比没有活力或不育花粉呈淡黄色。方差分析(表1)表明，散粉后4～6 h的着色率在80.6%～86.6%，无显著差异，此阶段表现出强的花粉活力；2～10 h的花粉萌发率大于50%。散粉8 h以后，花粉染色数量呈下降趋势，且大部分花粉都呈现粉红色或淡粉色；散粉36～72 h的着色率无极显著差异；36 h后的花粉着色率为10.1%，且都染为淡粉红色，表现出花粉活力弱；48 h以后花粉着色率为2.1%，其余全部呈现淡黄色，花粉已无活力。

花药散粉后无论何时取样检测，经醋酸洋红染色，有活力花粉和对照处理过的无活力或不育花粉染色率均被染成紫红色，各处理间无显著或极显著差异，没有获得可以鉴定花粉活性的指标，因而无法区分和判断花粉活力。

花药散粉后无论何时取样检测，经碘-碘化钾染色，有活力花粉和对照处理过的无活力或不育花粉在染色过程中，花粉在极短的时间内由黄色变成金黄色或黄褐色，着色和变色的速度都非常快，肉眼无法观察区分，花粉最终均被染成金黄色或黄褐色，各处理间无显著或极显著差异，没有获得可以鉴定花粉活性的指标，因而无法区分和判断花粉活力。

2.2.2高葶韭花粉的萌发 试验结果表明，离体萌发法测定高葶韭花粉生长能力的适宜蔗糖质量分数为10%，不添加或添加过多蔗糖都显著或极显著影响花粉萌发和花粉管生长。在此试验结果基础上采用10%蔗糖配比的培养基进行花粉生长能力分析，方差分析(表1)表明，散粉后6 h花粉萌发率最高，表现出强的花粉活力，与其他时间的花粉萌发率存在极显著差异。 2～10 h的花粉萌发率大于50%。散粉6 h以后，花粉萌发率呈下降趋势，48 h以后花粉萌发率为0，花粉已无活力。

通过5种染色检验方法以及1种萌发法测定高葶韭花粉育性表明，TTC、MTT、联苯胺和离体萌发可以用来检验高葶韭花粉活力和花粉萌发率(图2、图3)，而醋酸洋红和碘-碘化钾这2种方法不能真实反映高葶韭花粉活力的变化，因此不适合高葶韭花粉育性的测定。不同检测手段试验结果表明，高葶韭花粉是可育的，其花粉育性的变化规律也是一致的，高葶韭花粉活力最强的时期在2～8 h，花粉活力(萌发率)超过 50%(图3)。

3 讨论与结论

雄蕊开花进程中的形态特征变化表明，高葶韭具有雌雄异熟、雄蕊先熟于雌蕊的花部特征，直接影响着开花、授粉等有性繁殖过程，从而影响种子形成。其6枚花药分别伸出分别散粉，花药和花粉逐次逐级呈现相对延长了散粉的总时间，最大程度让花粉资源有效利用，保障传粉的成功，是对新疆干旱半干旱地理气候条件的长期适应的结果，与新疆其他野生葱属植物的开花动态也具有类似特点[16-17]。与新疆荒漠植物的繁殖特点具有一定的一致性[18]。开花特点表明高葶韭为日开型花，4～5 d花期属于短寿命花。

图2 高葶韭花粉育性测定

图3 高葶韭花粉活力与花粉萌发率

高葶韭花药散粉后，花粉高于50%的活力或萌发率只能维持2～10 h，48 h后无活力或萌发率，属于短寿命花粉。这与经氯化三苯基四氮唑染色法检测3种野生葱属植物蒙古韭、碱韭和细叶韭花粉活力的结果一致，花粉活力均在开花初期较高，花粉寿命均约8 h[19]。生产实践中，为了解决亲本花期不一致或远距离杂交的困难，需要保存花粉的活力，因此花粉生活力测定是进行人工辅助授粉或杂交授粉的基础，同样，也是高葶韭野生植物资源保护和合理开发利用的前提。

在许多植物资源花粉育性检验中都存在适宜的检测手段[20-21]，韭菜花粉活力检测的最佳方法是离体萌发法，而碘-碘化钾法、TTC法和无机酸法不适合韭菜花粉生活力的检测[22]，由于单一染料只反映花粉细胞胞质发育的一个指标，因而本试验采用多种染色方法更客观地判断花粉的活性，TTC染色法、MTT法、联苯胺法、离体萌发法适用于测定高葶韭花粉育性，且可以通过颜色变化将花粉活力分级，而醋酸洋红法、碘-碘化钾法不适用于测定高葶韭花粉育性，可为野外操作提供更加实用、便捷、可靠的方法，需要强调的是花粉活力测定研究中一定要将人工杀死的花粉设置成无活力花粉作为对照，比较它们之间的花粉着色能力有助于提高试验结果的准确性和可靠性。

花粉活力测定方法表现出的选择性是与花粉体内各种酶活性和物质含量与组成相关，为进一步开展小孢子培养、花粉发育与花药内源激素变化、花粉生理结构与代谢特点、花粉生态适应性、外源物质对花粉育性调控、花粉育性与结实关系等方面研究提供有价值的参考。

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