高羊茅雄性不育株花粉母细胞减数分裂染色体行为观察

2012-03-13吴佳海王小利

草业科学 2012年4期

付薇，吴佳海，陈伟，王小利，牟琼

(贵州省草业研究所，贵州贵阳 550006)

高羊茅(Festucaarundinacea)是禾本科羊茅属的一种多年生草本植物，它可用作长期放牧草地的优良牧草，经过选育后，高羊茅也是适应性很广的优良草坪草种[1]。贵州省草业研究所经过多年的田间寻找，于1998年6月在该所试验驻地发现了一株高羊茅雄性不育植株，现处于鉴定初期[2]。目前，国内雄性不育系的研究报道多见于作物品种[3-5]，牧草及草坪草雄性不育的研究利用相对较少。国外，法国已把黑麦草(Loliumperenne)的雄性不育系用于生产，加拿大选育出苜蓿(Medicagosativa)雄性不育系20DRE。对三叶草(Trifoliumrepens)、苏丹草(Sorghumsudanense)的雄性不育也有一些研究[6]，但高羊茅雄性不育系的发现及利用至今未见报道。

目前，国内对高羊茅的研究主要集中在良种选育[7]、引种适应性[8]、栽培技术[9-10]、愈伤组织培养[11]、分子标记[12]等方面。有关高羊茅细胞学的研究较少，仅见于蔡华等[13]、白宇辉和陈阳莉[14]对高羊茅核型分析报道，而针对雄性不育植株的研究更为鲜见。因此，本试验以贵州省草业研究所发现的高羊茅雄性不育株(编号A072003)为材料，采用卡宝品红染色制片法，对花粉母细胞减数分裂过程及异常行为进行较为细致的观察，以期揭示高羊茅不育材料花粉母细胞减数分裂过程中染色体变化的行为规律，寻找高羊茅花粉败育的细胞学依据，丰富高羊茅的细胞遗传学内容，为高羊茅发育生物学及小孢子败育等方面提供必要的细胞遗传学信息，为利用高羊茅雄性不育株开展杂交育种工作，选育一批适用于草坪及饲草兼水保功能的优良品种奠定理论基础，也为高羊茅发育生物学和育种学提供必要的细胞遗传学信息。

1 材料与方法

1.1材料以贵州省草业研究所独山基地内种植的高羊茅雄性不育植株(编号A072003)为试材，选取抽穗初期的高羊茅花序进行试验。

1.2方法于2011年5月上旬，采用连续取材观察的方法于早晨9:00至中午12:30，选取生长健康的高羊茅幼穗，用卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰乙酸体积比为3∶1)于室温下固定3 h后，用95%的乙醇清洗3次，转入70%乙醇中，4 ℃冰箱保存。采用压片法制取减数分裂制片。用镊子夹取花药，将其置于载玻片上，加1滴卡宝品红进行染色，然后用镊子夹破(花粉囊)，挤出花粉母细胞，并尽可能地将其夹碎，去残渣，染色1～3 min后，加盖玻片并紧压，使花粉母细胞进一步分散，用吸水纸吸去多余的染色剂后于日本OLYMPUS公司BH-2型多功能光学显微镜下镜检，放大倍数为40×10倍，并用Adobe Photoshop 7.0对图片的亮度和对比度进行优化。

2 结果与分析

2.1花粉母细胞减数分裂与花蕾形态特征相关性高羊茅每朵小花具有3枚花药，通过取样观察，发现A072003材料的花粉母细胞的发育程度与小花大小、花药长度、花药颜色紧密相关，处于减数分裂期的小花纵径为0.05～0.07 cm，花药长度为0.07～0.18 cm，此间大小的小花能够观察到花粉发育的各个时期(表1)。

2.2高羊茅花粉母细胞减数分裂染色体行为观察通过卡诺液固定、卡宝品红染色、压片及镜检等操作，本试验观察到了部分高羊茅在减数分裂过程中染色体的一系列行为变化特征。

表1 花粉母细胞减数分裂进程与花器官形态比较

2.2.1第1次减数分裂减数分裂的细线期，细胞核内的染色体细长如线，核仁处于核膜附近，在这一时期染色体相互缠绕，密集簇拥到核的一边(图1A)。偶线期，细胞核内同源染色体联会，染色体开始逐步的分散开，较之于细线期略微变短、增粗，但颜色较浅，显微镜下无法辨认染色单体(图1B)。此时，由于同源染色体的联会配对，染色体继续螺旋化变短加粗，颜色加深，减数分裂进入粗线期 (图1C)。双线期，染色体进一步螺旋化缩短变粗，配对的同源染色体彼此排斥并开始分离，但不完全分开，发生过交换的部位仍连在一起，形成交叉结，并能观察棒状、环状和V状二价体(图1D)。当减数分裂进行至终变期，染色体超螺旋化，二价体缩至最短，呈现出“纽扣状”形态，染色体向核周边移动，均匀分散排列于细胞核内，核仁变小并逐步消失(图1E)。中期Ⅰ时，核膜、核仁消失，纺锤体形成，染色体高度凝缩，二价体整齐地聚集在赤道板上，行为特征主要表现为“环形”和“重叠型”(图1F)。后期Ⅰ，二价体中的2条同源染色体在纺锤丝的牵引下彼此分开并向两极移动，此时父母本染色体得以重组 (图1G)。末期Ⅰ染色体移到两极后松散变细，逐渐形成2个子核，但细胞质不分裂(图1H)。

2.2.2第2次减数分裂高羊茅花粉母细胞在第1次减数分裂完毕之后，细胞核没有DNA复制，染色质在很短的时间内通过螺旋化缩短、变粗，进入前期Ⅱ时期(图1I)。到了中期Ⅱ，染色体显著缩短，每个染色体的着丝点排列在赤道板上面，纺锤丝中部明显(图1J)。后期Ⅱ可观察到着丝粒一分为二，位于赤道板上的姐妹染色单体在各自纺锤丝的牵引下向细胞两极移动(图1K)。末期Ⅱ染色体被拉向两极，纺锤丝消失，核膜、核仁出现，染色体又变细长，形成4个圆形的新核(图1L)。此时核周围形成细胞壁，4个子细胞紧密相连发育成四分体小孢子(图1M)。四分体初期细胞质浓厚、细胞壁不明显，以后体积慢慢变大，发育为成熟游离花粉粒。

2.3高羊茅花粉母细胞减数分裂周期不同步现象高羊茅花粉母细胞减数分裂过程中，存在着一定程度的非同步性分裂现象，主要表现在，高羊茅同一花序的不同小花内、同一朵小花的不同花药内，更甚是同一花药内都存在减数分裂时期不同步的现象，制片中可同时观察到不同减数分裂时期并存的现象(如：后期Ⅱ、末期Ⅱ、四分体时期并存，末期Ⅰ、前期Ⅱ并存)(图1N、图1O)。因此，在高羊茅花粉母细胞减数分裂的同一制片中可观察到大量2～4个不同时期的分裂相。

图1 高羊茅花粉母细胞减数分裂过程及分裂不同步性

2.4高羊茅花粉母细胞分裂异常行为高羊茅雄性不育材料的花粉母细胞减数分裂过程大量存在单价体、染色体桥、落后染色体、微核、不同步分裂等异常现象，减数分裂产物有三分体(图2A)，中期Ⅱ可观察到少量呈60°角的纺锤体(图2B)。

2.4.1单价体在减数分裂的终变期，大量花粉母细胞存在因没有同源染色体而不能联会的单价体，这些单价体因不配对常呈棒状或弯曲成V形而独立于赤道板之外(图2C)，有时其自身的两臂也会配对发生交叉而成环状(图2D)。

2.4.2染色体桥和片段在减数分裂中，正常的染色体同倒位染色体之间发生交叉互换，会使配子染色体上某一区段缺失或重复，两条同源染色体无法直线配对，而是以一个圆圈完成同源部分的配对，这个由两条同源染色体形成的圈被称作倒位环。一个倒位杂合体如果着丝粒在倒位环的外面，则在减数分裂后期会出现“染色体桥”(图2E)和“片段”(图2F)的现象，即一条染色单体的两端都有一个着丝粒，成为跨越两端的“桥”，同时伴随一个没有着丝粒的断片。染色体桥在染色体移向两极进入子细胞时被拉断，造成很大缺失，而染色体断片则不能进入子细胞的核内，所以由此形成的配子往往是死亡的。

2.4.3落后染色体花粉母细胞在分裂过程中受到损伤，导致染色体不同步移动或者不移动形成落后染色体，这一异常分裂现象在减数分裂中期Ⅰ，后期Ⅰ，后期Ⅱ和末期Ⅱ都有发现(图2G、2H、2I、2J)，减数分裂过程单价体及落后染色体的存在证明了高羊茅雄性不育株的基因组具有较强的杂合性。

2.4.4不同步分裂高羊茅不育材料中有少数花粉母细胞由于纺锤丝异常，2个子细胞在分裂时不伴随胞质同步分裂而成，如2个子细胞中，其中一个子细胞的染色体正在纺锤丝牵引下向两极移动，而另外一个子细胞的染色体已经全部聚集在两极(图2K、图2L)。

2.4.5微核微核主要是由染色体断片、落后染色体引起的，发生断裂或滞后的染色体不能随纺锤丝的牵引进入两极，或滞留于赤道板上，或随机分布在主核之外，逐渐形成直径小于主核的圆形或椭圆形微小核，一直到末期Ⅱ再形成微核，这类细胞形成的配子部分不育。该异常现象在中期Ⅱ、前期Ⅰ、四分体时期比较常见(图2M，2N，2O)。

3 讨论与结论

本试验中，高羊茅减数分裂进程与小花大小、花药长度、颜色有密切关系，通过分析花器官形态特征与减数分裂进程的相关性，并充分利用这种相关性估测减数分裂进程可取得事半功倍的效果。本试验发现，高羊茅不育株A072003处于减数分裂期时的小花纵径为0.05～0.07 cm，花药长度为0.07～0.18 cm，此间大小的小花能够观察到花粉发育的各个时期。以花药长度、颜色作为减数分裂进程、花粉粒成熟度的主要判断依据，比较简便、直观。不过，由于高羊茅穗子发育与播种时间、土壤环境、气候条件等密切相关，因此以小花、花药大小、色泽作为采样依据，本研究只是一种探索总结，是否适用于其他高羊茅不育材料还有待进一步证实。

试验中还发现，高羊茅花粉母细胞减数分裂过程存在着一定程度的非同步性分裂现象，同一花序的不同小花内、同一朵小花的不同花药内，更甚是同一花药内都存在减数分裂时期不同步的现象。因此，在高羊茅花粉母细胞减数分裂的同一制片中可观察到2～4个不同时期的分裂，这一不同步现象在辛培尧等[15]、张伟等[16]、张彩霞等[17]研究中都有报道。王君等[18]在观察通辽杨(PopulussimoniiCarr×P.nigraL.‘Tongliao’)减数分裂染色体行为过程中也曾指出，各个分裂相的不同步性可以起到延长花期的作用，也有利于增加两性功能，对种群繁殖后代有利，是植物适应当地环境条件的一种进化表现。田如霞等[19]在研究锦鸡儿(Caraganamicrophylla)花粉母细胞染色体行为中也表明，减数分裂的不同步现象反映出异花授粉植物的同步性比自花授粉植物低的一般规律。

本研究发现了染色体桥、片段、落后染色体、微核、不均分离等异常现象。其中落后染色体的频率最高，在中期Ⅰ、后期Ⅱ、中期Ⅲ、后期Ⅳ 4个时期中均能发现，可能是由于某些染色体同源化程度不高导致的。而往往花粉的育性与花粉母细胞减数分裂过程紧密相关，高羊茅雄性不育材料花粉母细胞减数分裂过程中出现了大量的染色体桥和片段，而在分裂后期Ⅰ这些染色单体桥在倒位环内只有一次交换，涉及2条染色单体产生的配子50%可育，当别的染色体分向两极时，桥也拉长，一直到拉断形成染色体断片为止。这一观察同何丽霞[20]在黄牡丹(Paeonialutea)花粉母细胞减数分裂过程当中及栗茂腾和蔡和田[21]在披碱草减数分裂中所发现的现象相似。潘泽惠等[21]在观察伞形科植物减数分裂时认为，一些种类的染色体发生杂合性结构差异，致使减数分裂时产生双着丝点染色体，在后期Ⅰ形成染色体桥和断片。后期Ⅰ染色体桥是一种不稳定结构，在以后的细胞分裂过程中将开始“断裂-融合一桥”循环，致使这条染色体从细胞中丢失，结果导致遗传物质的减少。此外，由于落后染色体和染色体桥造成了染色体的不均匀分配，导致了减数分裂的一些异常结果，形成有遗传组成不平衡的配子，产生不同遗传组成的花粉粒。以上都是导致高羊茅花粉败育的重要原因之一。本研究还在终变期发现了大量的单价体，有棒状、V状、环状单价体，这种环状单价体在小麦(Triticumaestivum)中已有报道，李万隆和李振声[23]指出环状单价体的研究对染色体特异性配对等基本理论问题有重要的意义。张正海等[24]在小胡杨(Populussimonii×P.euphratica)染色体行为观察中指出，小胡杨二分体和三分体的形成是由于中期Ⅱ纺锤体的合并以及减数第2次分裂的不同步所造成的，纺锤体行为影响着减数分裂的胞质分裂，从而导致二分体、三分体等不同构型的减数分裂产物出现。由此分析，本试验第2次减数分裂过程中观察到的三分体，可能同中期Ⅱ中发现的60°角纺锤体有关。三分体、二分体或包含微小孢子的二分体释放出的小孢子可能将形成未减数分裂花粉，导致败育。