多浆旱生植物霸王质膜Na╋/H╋逆向转运蛋白基因RNAi载体构建

马 清，王锁民

(草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

霸王(Zygophyllumxanthoxylum)为蒺藜科(Zygophyllaceae)多浆旱生灌木，其抗逆性强，是亚洲中部荒漠区的特有植物种，也是我国西部荒漠区植被组成的优势建群种，具有很高的生态和饲用价值[1-4]。Wang等[5]发现霸王适应干旱环境的最有效策略是吸收并积累大量的Na+。进一步分析发现，干旱胁迫下，霸王存在着一种非常强大的长距离运输能力，能够将根系吸收的大量Na+及时有效地转运至叶中，用以维持细胞的渗透势[6-7]，而质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1可能在植物体内Na+的长距离运输及空间分配中发挥重要作用[8-9]。为此，兰州大学草类逆境生理与基因工程实验室从霸王中克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxSOS1(Genebank登录号:GU177864)，但ZxSOS1在霸王体内Na+转运中的功能及其在霸王适应干旱生境中的作用机制尚不清楚。

在基因功能研究中，RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)已成为一种简单、高效、特异和成本相对低廉的研究手段，它可以在mRNA水平上使特定基因的表达活性丧失或下降，从而获得功能性突变或丧失，进而可根据表型变化鉴定目标基因的功能[10-11]。因此，本研究构建以霸王ZxSOS1基因为靶标的、具有反向重复发卡结构的RNAi表达载体，旨在为利用RNAi技术深入研究ZxSOS1在霸王体内Na+长距离运输及空间分配中的功能及其作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料 霸王种子于2006年7月采自内蒙古阿拉善左旗巴彦浩特。pHANNIBAL质粒、PART27质粒和大肠杆菌E.coliDH5α菌株均为兰州大学草类逆境生理与基因工程实验室保存，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.2试剂 UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、MMLV第一链cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒和UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程公司，克隆载体pGM18-T Easy vector、限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司，DNA marker购自北京天根生化科技有限公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1总RNA的提取 取50 mmol·L-1NaCl处理24 h的3周龄霸王幼苗根系，加入液氮研磨至粉末状，按照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒的操作说明书提取根系总RNA。用1.0%甲醛变性凝胶电泳鉴定其完整性和质量。

1.2.2ZxSOS1基因RNAi靶位片段的扩增 cDNA第一链的合成按照MMLV第一链cDNA合成试剂盒的操作说明进行。

利用GenBank中的RNAi设计库对ZxSOS1基因的靶位区段进行筛选，选取629 bp(第2 750～3 379位碱基)区段作为RNAi最佳靶位区段设计一对特异性引物，为了便于定向连接到中间载体pHANNIBAL，在上游引物P1上引入酶切位点Xba Ⅰ和Xho Ⅰ序列，下游引物P2上引入酶切位点Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ序列。具体引物序列如下(划线部分为酶切位点序列)：

P1:5′-TCTAGACTCGAGTCAACAATGACTGTATACTT-3′；

P2:5′-AAGCTTGGTACCAATTTCCTCAAATCACGCTT-3′。

PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl23 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL，10 μmol·L-1P1 1 μL，10 μmol·L-1P2 1 μL，Taq DNA polymerase (5 U· μL-1)0.5 μL，cDNA 2 μL，加水至50 μL。反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s、53 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶检测，目的片断的回收和纯化按照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作说明进行。回收的PCR产物连接到pGM18-T Easy vector载体，转化感受态大肠杆菌E.coliDH5α，用含有50 g·mL-1氨苄青霉素的LB固体培养基进行蓝白斑筛选，阳性克隆经质粒PCR鉴定确认后，送至华大基因科技股份有限公司进行基因测序，使用DNAMAN生物软件对序列进行分析。

1.2.3以ZxSOS1为靶标的RNAi载体构建 用Xho /ⅠKpn Ⅰ双酶切pGM18-T Easy vector载体，回收小片段(S1)，与经同样双酶切并回收的载体pHANNIBAL连接，转化感受态E.coliDH5α，得到重组质粒pHS1；然后用Xba Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切pGM18-T Easy vector载体并回收反向小片段(S2)，与经同样双酶切并回收的pHS1载体相连，得到以pHANNIBAL载体的内含子(intron)部位作为间隔区的、具有发卡反向重复序列的中间载体pHS1S2(图1)；最后用Sac Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切pHS1S2，回收大片段，与经同样酶切回收的PART27载体相连，得到具有ZxSOS1反向重复序列的植物RNAi表达载体PARS(图2)。

图1 中间载体pHS1S2的构建

图2 ZxSOS1 RNAi载体PARS的构建

2 结果与分析

2.1总RNA的提取及检测 以霸王根系为材料提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳检测结果显示28 S rRNA、18 S rRNA条带清晰(图3)，前者亮度约是后者的2倍，说明所提取的RNA完整性较好；经NANODROP1000核酸蛋白检测仪测得OD260 nm/OD280 nm平均值为2.01，表明RNA纯度较高，可以用于RT-PCR扩增实验。

图3 霸王根系总RNA的甲醛变性凝胶电泳图

2.2ZxSOS1基因靶位片段的确定及扩增 利用GenBank中的RNAi 设计库对ZxSOS1基因的靶位区段进行筛选，结果表明，ZxSOS1基因从起始密码开始第2 750～3 379位碱基共629 bp的片段为保守区段。以总RNA反转录所得到的第一链cDNA为模板，用特异引物P1和P2进行PCR扩增，得到了预期大小的特异条带(图4)。将此条带回收纯化后连接到pGM18-T Easy vector载体上，转化E.coliDH5α。从转化的平板上随机挑取3个菌斑并提取质粒，进行PCR扩增，得到了629 bp的预期条带(结果未显示)，表明这些克隆为阳性克隆。对其进行测序后分析表明，该序列与ZxSOS1基因相应区段同源性100%(结果未显示)，说明已成功扩增到目的片段。

图4 RT-PCR产物凝胶电泳图

2.3以ZxSOS1为靶标的RNAi载体构建 按照ZxSOS1 RNAi植物表达载体的构建流程(图1、图2)，通过酶切和连接的方法，构建了具有ZxSOS1反向重复序列的植物RNAi表达载体PARS。通过PCR检测鉴定出PARS的阳性重组质粒后(图5)，根据PARS载体上的限制性位点对其进行如下酶切分析：经Xho Ⅰ/Kpn Ⅰ双酶切后，在800和629 bp处出现特异条带(图6，泳道1)，分别与PDK intron和S1片段大小相符；经Xba Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切后，在629 bp处出现特异条带(图6，泳道2)，与S2片段大小相符；经Sac Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切后，在约4 500 bp处出现特异条带(图6，泳道3)，与CaMV 35S启动子、S1、PDK intron、S2及OCS终止子片段之和大小相符。以上结果表明，以ZxSOS1为靶标的RNAi载体已经构建成功。

图5 PARS重组质粒阳性克隆的PCR鉴定

3 讨论与结论

生长在荒漠地区的多浆旱生植物霸王具有极强的抗逆性，可能蕴藏着丰富的抗逆基因资源[7]。基因沉默是研究基因功能的常用手段，包括反义核酸、基因敲除和RNAi等技术[12]。相比其他基因沉默方法，RNAi具有高效性，只需要少量小干扰RNA(small-interference RNA,siRNA)或双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)即可使特定基因沉默[11,13]；且沉默效应能通过植物胞间连丝及韧皮部进行系统扩散[14-19]；同时植物中的RNAi沉默效应可以从起始siRNA同源区向临近的5′和3′端扩散，进而可增强基因沉默的效果[20]。因此，RNAi已逐渐成为一种研究植物基因功能的强有力工具。

图6 PARS的酶切分析

RNAi的关键是其载体的构建，载体结构、靶基因序列长度及其在靶基因中的位置将直接影响基因沉默的效果[21]。RNAi载体以含有2个反向重复序列中间夹1个内含子所形成ihpRNA发卡结构的沉默效果最好，平均比例较高，超过90%[22]，其发夹结构臂序列的长度具有一定的可塑性，一般在100～1 200 bp[23]。Elbashir等[24]和Reynolds等[25]建议靶基因序列应在基因转录起始位点下游100个核苷酸以后，且该段DNA的GC含量在40%～52%。本研究构建的RNAi载体的2个反向重复序列臂之间具有内含子，且两臂大小也在目前公认的序列长度范围之内，选取的ZxSOS1基因靶序列GC含量为44%。因此，该载体完全满足高效RNAi载体的条件，理论上将会对ZxSOS1基因产生较好的沉默效果。

[1]赵一之,朱宗元.亚洲中部荒漠区的植物特有属[J].云南植物研究,2003,25(2):113-121.

[2]杨鑫光,傅华,牛得草.干旱胁迫下幼苗期霸王的生理响应[J].草业学报,2007,16(5):107-112.

[3]周向睿,周志宇,吴彩霞.霸王繁殖特性的研究[J].草业科学,2006,23(6):38-41.

[4]吴彩霞,周志宇,庄光辉,等.强旱生植物霸王和红砂地上部营养物质含量及其季节动态[J].草业科学,2004,21(3):30-34.

[5]Wang S M,Wan C G,Wang Y R,etal.The characteristics of Na+,K+and free proline distribution in several drought resistant plants of the Alxa Desert,China[J].Journal of Arid Environments,2004,56:525-539.

[6]李三相.Na+与多浆旱生植物霸王抗旱性研究[D].兰州:兰州大学,2006.

[7]Wu G Q,Xi J J,Wang Q,etal.The ZxNHX gene encoding tonoplast Na+/H+antiporter from the xerophyteZygophyllumxanthoxylumplays important roles in response to salt and drought[J].Journal of Plant Physiology,2011,168:758-767.

[8]Shi H,Quintero F J,Pardo J M,etal.The putative plasma membrane Na+/H+antiporter SOS1 controls long distance Na+transport in plants[J].Plant Cel1,2002，14:465-477.

[9]Olías R,Eljakaoui Z,Li J,etal.The plasma membrane Na+/H+antiporter SOS1 is essential for salt tolerance in tomato and affects the partitioning of Na+between plant organs[J].Plant,Cell and Environment,2009,32:904-916.

[10]Fire A,Xu S,Montgomery M K,etal.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391:806-811.

[11]Meister G,Tuschl T.Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA[J].Nature,2004,431:343-349.

[12]殷勤伟.siRNA介导的基因沉默[J].生物物理学报,2004,20(2):85-95.

[13]Baulcombe D.RNA silencing in plants[J].Nature,2004,431：356-363.

[14]Mallory A C,Mlotshwa S,Bowman L H,etal.The capacity of transgenic tobacco to send a systemic RNA silencing signal depends on the nature of the inducing transgene locus[J].The Plant Journal,2003,35:82-92.

[15]Palauqui J C,Balzergue S.Activation of systemic acquired silencing by localised introduction of DNA[J].Current Biology,1999,9:59-66.

[16]Palauqui J C,Elmayan T,Pollien J M,etal.Systemic acquired silencing: transgene-specific post- transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions[J].The EMBO Journal,1997,16:4738-4745.

[17]Sonoda S,Nishiguchi M.Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants[J].The Plant Journal,2000,21:1-8.

[18]Tournier B,Tabler M,Kalantidis K.Phloem flow strongly influences the systemic spread of silencing in GFPNicotianabenthamianaplants[J].The Plant Journal,2006,47:383-394.

[19]Voinnet O,Vain P,Angell S.Systemic spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA[J].Cell,1998,95:177-187.

[20]白描,杨国顺,陈石,等.植物RNAi的特点及其应用研究进展[J].生物技术通报,2009(8):6-10.

[21]许德晖,黄辰,刘利英,等.高效siRNA设计的研究进展[J].遗传,2006,28(11):1457-1461.

[22]Wesley S V,Helliwell C A,Smith N A,etal.Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[J].The Plant Journal,2001,27:581-590.

[23]Hirai S,Oka S,Adachi E,etal.The effect s of spacer sequences on silencing efficiency of plant RNAi vectors[J].Plant Cell Reports,2007,26:651-659.

[24]Elbashir S M,Lendeckel W,Tuschl T.RNA interference is mediated by 21- and 22- nucleotide RNAs[J].Genes and Development,2001,15:188-200.

[25]Reynolds A,Leake D,Boese Q,etal.Rational siRNA design for RNA interference[J].Nature Biotechnology,2004,22:326-330.