大豆食心虫28SrDNA基因的克隆及表达分析

李冬梅，孟凡立，王志坤，臧振源，孙 晶，李文滨

（东北农业大学农学院，大豆生物学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella Matsumurav）属鳞翅目（Lepidoptera）小卷蛾科（Olethreutidae），是东北大豆产区最严重的一种害虫，以幼虫钻蛀豆荚取食豆粒，将豆粒咬成沟道或残破状，严重影响大豆产量和品质[1]。豆农每年至少使用2次化学杀虫剂对大豆食心虫进行防治。现在使用的化学杀虫剂多为广谱性杀虫剂，可杀死目标昆虫，也会杀死有益昆虫。同时化学杀虫剂在自然界可长期存在，在土壤和河流中逐渐积累，破坏土壤和河流的生态环境；化学杀虫剂还可以通过食物链进入人体，诱发致畸、致癌，严重损害健康。利用传统育种方法培育抗大豆食心虫的大豆品种虽有效，但周期长、效率低。因而，急需探索防治大豆食心虫的新方法，以精确、高效地控制大豆食心虫。

Fire等在研究反义RNA在线虫Caenorhabditis elagans中的基因阻断作用时，首先发现利用纯化的外源dsRNA能够高效特异性阻断内源基因表达，并将这一现象称为 RNAi（RNA interference）[2]。由于RNAi技术沉默基因的高效性和特异性，人们提出通过转基因手段，让植物体内表达昆虫基因的dsRNA，dsRNA经昆虫取食后进入虫体内，对昆虫靶基因进行RNA干扰，从而特异性抑制靶基因表达，提高植物抗虫性[3-6]。中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所陈晓亚院士实验室的研究成果证明，昆虫取食表达dsRNA的转基因植物后，体内相应的靶基因受到抑制，提高植物的抗虫性[7]。Mao等先通过转基因手段，让拟南芥和烟草表达棉铃虫参与棉毒素解毒的P450基因dsRNA。然后，利用转基因植物喂食棉铃虫，dsRNA从食道进入细胞，抑制棉铃虫体内P450基因的表达，致使棉铃虫对棉子酚的抗性降低。最后，对棉铃虫造成致命的影响[8]。孟山都公司报道表明，玉米根虫V-ATPase基因被转基因玉米表达的siRNA抑制，转基因玉米根部遭受的破坏要比对照植株显著降低[9]。以上研究结果表明，dsRNA可以通过取食从植物传递到昆虫体内，通过植物介导的RNAi技术可以干扰害虫的重要基因，达到防治害虫的目的，为利用RNAi技术培育新一代抗虫转基因作物提供重要的科学依据。

核糖体是普遍存在于各种细胞内的细胞器，由大小两个亚基组成，是蛋白质合成的唯一场所。核糖体含有50%～60%的核糖体RNA（rRNA），其余为蛋白质。近年，国内外的研究表明，核糖体RNA（rRNA）不仅是构成核糖体的主要成分，还具有自我复制和自我剪切功能[10]，在蛋白质合成中起重要作用[11]。28SrRNA是核糖体RNA主要成员之一，是生物的关键生长基因。因此，本试验根据GenBank上已经发表的昆虫28SrDNA基因序列，利用28SrDNA基因序列的保守区域，克隆大豆食心虫28SrDNA序列全长，利用荧光定量PCR对大豆食心虫不同生育时期和幼虫的不同组织的28SrDNA表达量进行分析后，构建表达大豆食心虫28SrDNA dsRNA的重组载体L4440-28SrDNA，为进一步研究RNA干扰技术防治大豆食心虫奠定基础。

[1]Laufer,B.&P.,Nation.(1999).A Vocabulary Size Test of Controlled Productive Ability,Language Testing,16(1).33-51.

1 材料与方法

1.1 材料

2010年7月末8月初大豆田间出现大豆食心虫成虫开始，收集卵、幼虫、蛹、成虫四个时期的大豆食心虫样品，将收集的虫样分别放入无Rnase的EP管中，立即放入液氮中冷冻，然后存于-80℃低温冰箱，每个处理重复3次。选取大豆食心虫3～4龄幼虫进行解剖，剖取神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体组织后，分别放入无Rnase的EP管中，立即放入-80℃低温冰箱中保存。

DNA提取、PCR、电泳所用试剂均购自上海生工公司，测序由华大基因有限公司完成、OMEGA胶回收试剂盒、Trizol reagen试剂盒、MEGA4.0软件、DNAman 5.2.2软件、载体L4440和菌种HT115均由美国线虫遗传学中心提供。

嵌入式计算机在接到指定任务后，必须在规定时间内给出实时应答，这是区别嵌入式计算机与通用计算机的一个重要特征，实时性涉及到硬件的性能、软件的中断管理和调度算法等。

Design of Intelligent Balancing Vehicle Control System based on Arduino

2.3 术后硬膜下并发症影响因素分析 单因素分析结果(表3)表明：男性、高龄、动脉瘤部位、Fisher分级、脑萎缩程度及术后腰大池引流是破裂动脉瘤夹闭术后硬膜下并发症发生的潜在危险因素(P<0.05)。

1.2 方法

1.2.1 大豆食心虫基因组DNA的提取

种植双胞山药最好选择土质疏松、地势高燥、土层深厚、排灌方便、通气透水、保水保肥性能好的砂壤土。盐碱地、低洼积水地、卖窑泥地、地下异物多的地不能种山药。

县级设专职人影管理人员1名，作业人员4～5名(高炮作业人员除外)。防雹作业点均交由当地政府管理，施行乡镇武装部长主管、村干部管理、炮长负责的制度，每个作业点配备4名作业人员，一人为炮长，具体负责作业点管理、高炮维护、弹药交接、作业实施及空域请示，气象部门仅负责安全检查、作业指导和空域请示等。

根据GenBank上已经发表鳞翅目昆虫的银月豹凤蝶（Papilio troilus，登录号AF423920）；家蚕（Bombyx mori，登录号M31320）；雄鹿天蚕蛾（Hemileuca sp，登录号AF423922）；洋槐木蠹蛾（Prionoxystus robiniae，登录号AY521785）的28SrDNA序列，根据鳞翅目昆虫28SrDNA序列的保守区域设计两对简并引物用于扩增大豆食心虫28SrDNA序列全长，引物具体如下：

利用DNAMAN5.2.2和MEGA4.0软件进行序列分析。

P2：ATGGTGAACTATGCCTGGT;

P3：AACTTCGGAGGGAACCG；

P4：CCCTCCCTGRATTTCAAGGTCCG。

按昆虫DNA提取方法，利用试剂盒提取大豆食心虫幼虫DNA。

P1和P2预期的PCR扩增条带大小约为1100 bp，P3和P4约为1200 bp。

1.2.3 PCR扩增与检测

PCR反应体系为PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.3 μL，dNTPs 0.5 μL，10 mmol·L-1引物 1.0 μL，模板DNA 2.5 U 1.0 μL，ddH2O 19.7 μL。PCR循环条件为：95℃5 min；57.1℃1 min，72℃2 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。取4 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PCR产物的纯化

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，切下扩增的目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收PCR目的片段。

1.2.2 引物设计

1.2.5 荧光定量PCR

actin-a：5'ATCCTCCGTCTGGACTTGGC 3'

本文针对RBC的特点，考虑风险因素之间的影响，提出基于ANP和证据融合理论的风险评估模型，对RBC的风险等级进行评估。

利用Trizol reagent提取大豆食心虫卵、幼虫、蛹、成虫四个时期和神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织的总RNA，采用Fermentas公司M-MLV反转录酶合成cDNA。以cDNA为模板，利用荧光定量PCR对28SrDNA表达量进行检测。荧光定量PCR按照TOYOBO公司SYBR®Green Realtime PCR Master Mix-Plus-程序进行。荧光定量PCR反应中所使用的基因及其引物如下：

actin-s：5'GGCGACATAGCACAGCTTCTC 3'

那时实行大集体制，生产队按照家庭人口和挣得工分的多少，定期分给社员一些稻草、棉秆、松枝之类的东西用于做饭之用，但分配的那点柴草远远不能满足炊用的需要，家家都感觉到柴不够烧。棉秆、松枝还好烧一点，稻草一烧烟大灰多，做完一餐饭，是满面火灰，两眼通红。所以，弄柴就成了我们这些孩子上学之余的主要任务，逢放学或放假，村子中10多个中小学生就都扛着锄头、背上箢子、带上镰刀浩浩荡荡地到山上找柴，远山近坡能砍的都被我们砍光，能挖的都被我们挖完，山都变成了光秃秃的。

28S-a：5'ACGTTTGGTTCATCCCACAGC 3'

28S-s：5'CGGTAAAGCGAATGATTAGAGGC 3'

1.2.6 生物软件

P1：AGGATTYCCYBAGTAGCKGCGAGCGAA；

1.2.7 载体构建

利用内切酶XbaⅠ和HindⅢ分别双酶切具有双向T7启动子的载体L4440和28S rDNA目的片段，回收目标DNA片段，将纯化产物连接，对重组子经菌液PCR鉴定，得到阳性克隆，命名为L4440-2828SrDNA。

2 结果与分析

2.1 大豆食心虫28SrDNA基因克隆

从大豆食心虫基因组模板获得PCR扩增产物，引物1和引物2的扩增产物为1100 bp（见图1a），引物3和引物4的扩增产物为1200 bp（见图1b），并将PCR产物均进行测序，将两段序列拼接成全长的大豆食心虫28SrDNA序列，该序列长度为2127 bp。

在推进地下水超采治理试点工作中，始终牢牢把握五条基本原则：一是政府引导、全民行动，发挥好政府和群众两个积极性；二是规划统领、科学治理，年度实施方案与中长期规划有机衔接，集中连片规模实施，务求治理一片、见效一片、巩固一片；三是创新机制、示范带动，探索建立地下水超采治理的有效途径，力求取得可示范、可复制、可推广的经验；四是因地制宜、积极稳妥，根据实际情况，科学确定治理模式和工程规模；五是竞争立项、绩效考核，依据项目前期工作和压采效果择优实施，严格把关、严格奖惩。

图1 28SrDNA的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of 28SrDNA

将大豆食心虫28SrDNA序列和其他昆虫28SrDNA序列进行同源序列比较（见图2），发现大豆食心虫28SrDNA序列与蝎蛉（Anthocharis sara）、大蜡螟（Galleria mellonella）、粉蝶（Panorpa claripennis）、姬蜂（Poecilocryptus nigromaculatu）、家蚕（Bombyx mori）的28SrDNA同源性都在80%以上。采用MEGA4.0软件利用相邻连接法NJ（Neighborjoining method）构建系统进化树，结果表明，大豆食心虫的28SrDNA和鳞翅目家蚕的亲缘关系较近，分布在同一分支，与膜翅目姬蜂亲缘关系较远，处于不同分支。

图2 根据昆虫28SrDNA序列利用相邻连接（NJ）法构建的系统发生树Fig.2 Phylogenetic analysis of the sequences of 28SrDNA from insect by neighbor joining method

2.2 大豆食心虫28SrDNA基因的表达模式分析

为了确定大豆食心虫28SrDNA基因在大豆食心虫不同发育时期和大豆食心虫幼虫不同组织的表达情况，利用荧光定量PCR对28SrDNA mRNA的表达情况进行检测，结果表明，28SrDNA的rRNA在卵、幼虫、蛹、成虫各发育阶段均表达（见图3），其中成虫期（AD）28SrDNA的表达量最高，4龄幼虫（N4）、蛹（PU）和1龄幼虫(N1)的表达量较高，2龄幼虫（N2）和3龄幼虫（N3）表达量较低，卵中表达量最低。28SrDNA在神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织中均有表达，其中脂肪体（FT）和睾丸（TE）的相对表达量最高，神经节（SY）的表达量较高，表皮（CU）、唾腺（SA）、中肠（MD）和卵巢（OV）相对表达量较低（见图4）。

图3 28SrDNA在大豆食心虫不同发育阶段的表达量Fig.3 Transcript level of 28SrDNA in different development stage

图4 28SrDNA在大豆食心虫不同组织的表达量Fig.4 Transcript level of 28SrDNA in different tissues of soybean pod borer

2.3 构建表达dsRNA的重组载体L4440-28SrDNA

利用DNAman软件将大豆食心虫28SrDNA和人28SrDNA进行序列比较，选择同源性最低的大豆食心虫28SrDNA序列区域作为目标片段。根据分析结果设计引物，通过PCR扩增得到418 bp的扩增产物（见图5），纯化后克隆到pMD18-T上。将质粒pMD18T-28S与载体L4440用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，回收目的片段，将纯化产物连接，对重组子经菌液PCR鉴定，得到阳性克隆，命名为L4440-28SrDNA。重组质粒L4440-28SrDNA经XbaⅠ单酶切和XbaⅠ、HindⅢ双酶切（见图6），目的条带均与预期结果相符，表明构建的重组载体L4440-28SrDNA正确。

图5 28SrDNA目的片段的PCR扩增产物Fig.5 PCR amplification result of 28SrDNA

图6 重组质粒L4440-28SrDNA的双酶切鉴定Fig.6 Confirmation of recombinant plasmid L4440-28SrDNA by Xba I and Hind III

3 讨论

RNA干扰是利用外源导入或转录载体在体内转录的双链RNA介导受体细胞中的序列特异的同源性mRNA发生降解或翻译受阻，引发受体细胞产生转录后基因沉默，使与此相应的内源靶基因的表达被阻抑，从而得到类似于“基因敲除”的基因阻抑效果[12]。Fire等在线虫发现RNA干扰现象后，在真菌、植物、线虫、昆虫、斑马鱼、小鼠等大多数真核生物也发现RNAi现象，研究表明RNAi是生物进化过程中保留下来的一种抵抗微生物侵入、转座子扩展和对基因表达进行转录后调控的强大机制。由于RNAi沉默基因的高效性和特异性，将昆虫关键生长基因dsRNA导入昆虫体内细胞，dsRNA介导受体细胞内同源性mRNA发生降解，使昆虫体内与dsRNA相对应的靶基因表达被抑制，可以直接分析基因的功能。目前的主要问题是寻找一个向目标昆虫体内导入dsRNA简单而且稳定的方法。Timmons等发现给线虫喂食表达dsRNA的大肠杆菌或将线虫浸泡在dsRNA溶液中均能诱导线虫体内靶基因的沉默，表明dsRNA可以直接从环境（体内肠道和体表）进入到昆虫体内[13]。

目前，国内外尚无大豆食心虫RNA干扰的研究报道。本研究以大豆食心虫幼虫作为研究对象，利用同源克隆法克隆大豆食心虫28SrDNA全长序列。对大豆食心虫28SrDNA不同发育阶段和不同组织的表达量进行分析，结果表明，大豆食心虫28SrDNA在大豆食心虫的不同发育阶段的不同组织均有表达，在大豆食心虫生长发育阶段起关键作用。

本研究将28SrDNA的目的片段克隆到L4440载体上，该载体具有双T7强启动子，对目标基因片段的克隆不要求方向性，目的片段以何种方向连入，利用该载体的双T7强启动子均可以得到对应于目标基因的dsRNA。构建完的载体可转入E.coli HT115（DE3）中，该菌株含有T7RNA聚合酶基因，在T7强启动子的控制下进行该基因的转录，产生T7RNA聚合酶。而且该菌株还是一个Rnc基因突变菌株，不能编码降解dsRNA的内切酶RnaseⅢ的基因，这样在IPTG的诱导下，在E.coli HT115菌株中很容易产生大量的目的片段的dsRNA。因此该载体的成功构建，为利用喂食方法研究大豆食心虫28SrDNA基因的功能奠定基础，有利于进一步探索利用植物介导的RNA技术防治大豆食心虫。

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