植物提取物对瓜类枯萎病菌的抑菌活性

范海延*

（1 沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110866；2 武警辽宁总队后勤部农副业生产基地，辽宁沈阳 110866）

瓜类枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）寄生引起的一种土传病害，全国各菜区都有分布，危害多种瓜类作物，其中以黄瓜、西瓜、甜瓜等受害较重，病田一般减产20%～30%，严重田块可达50%～60%，甚至绝产。一直以来，化学防治是控制土传病害的主要手段，但随着化学农药的大量使用，产生了环境污染、农药抗性及农药残留等令人担忧的问题。因此，使用对生态环境无害的生防杀菌剂替代化学农药已经成为一种趋势。

植物是生物活性化合物的巨大天然宝库，其产生的次生代谢产物超过400 000 种，国内外研究已发现许多植物提取物中含有抑菌活性成分，在植物源杀菌剂开发和应用方面也取得了一定的成果（孟昭礼 等，1995，2002；于平儒 等，2001；李瑞 等，2006；乔康和姬小雪，2009；赵成爱 等，2010）。但从总体来看，国内外针对作物病害的植物源杀菌剂的应用开发研究还是比较落后，真正投入到市场上的植物源杀菌剂品种不多，还有待于加大植物源抗菌活性物质的基础研究，以开发出更多具有市场竞争力的植物源杀菌剂品种。本试验利用超声波辅助提取法从27 种植物中提取活性物质，采用生长速率法进行离体抑菌试验确定其对3 种瓜类枯萎病菌的抑菌活性，并对狼毒大戟、藿香、肉桂、黄檗等植物提取物进行预防性、治疗性和诱导抗病性的室内盆栽效果评价，旨为今后深入研究提供参考。

表1 供试植物

1 材料与方法

1.1 供试植物

老鹳草、茴茴蒜、白头翁、毛茛和白屈菜采于沈阳市东陵天柱山，狼毒大戟采自吉林省辽源市，其余药用植物购自沈阳同仁堂，详见表1。

1.2 供试菌种

供试菌种为黄瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporiumf.sp.cucumberinumOwen）、西瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum），由沈阳农业大学农业部北方农作物病害免疫实验室提供；甜瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）由中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室园艺作物病害诊断与控制研究组提供。

1.3 试验方法

试验于2008年11月～2009年11月在沈阳农业大学生物科学技术学院创新实验室进行。

1.3.1 植物提取物的制备 取粉碎的干燥植物材料5 g，按料液比1︰20 加入到80%乙醇溶液中，于60 ℃、700 W 功率下进行超声提取两次，每次超声时间为30 min，合并滤液并用旋转蒸发仪浓缩，再将浓缩液置于冷冻干燥机中干燥12 h，制成提取物干粉。

用5%乙醇溶液溶解干粉，配制成1.0 g·mL-1的植物粗提物母液，0～4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 植物粗提物对病原菌菌丝生长的抑制作用 在无菌条件下，取上述植物提取物1.0 mL，加入9.0 mL 热培养基，摇匀，对照组中加入等量的无菌水，倒入融化的PDA 培养基至10.0 mL，摇匀、制成平板。接种生长一致的供试菌菌饼（φ＝6.0 mm），使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，25 ℃下培养，于接种后第4 天用十字交叉法测定供试菌菌落的生长直径。抑菌试验共2个处理（培养基加植物提取液和培养基加0.5%乙醇的对照），每处理3 次重复。

菌落生长直径=菌落直径平均值-6.0 mm

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100%

1.3.3 活体盆栽试验 在PDA 培养基中活化黄瓜枯萎病菌，25 ℃下培养3 d，再转入PDA 液体培养基培养4～5 d，菌液过滤，除去菌丝，将滤液经5 000 r·min-1离心10 min，取沉淀加蒸馏水稀释成孢子浓度为5×105个·mL-1的悬浮液，备用。将黄瓜种子放入无菌水中催发24 h，选取健康的萌发种子栽种于新育苗钵内，基质为草炭和蛭石，温室中正常管理，待黄瓜长至两叶一心时进行试验处理。

预防效果测定：在黄瓜幼苗植株根部分别灌入一定浓度的植物提取物5 mL，对照灌入5 mL 无菌水，2 h 后每株幼苗定量灌注5 mL 黄瓜枯萎病菌悬浮液，并于夜间进行保湿培养。每处理30 株，3 次重复，待空白对照充分发病后进行病情分级调查，并计算病情指数和防治效果。

治疗效果测定：在每株黄瓜幼苗植株根部定量灌注5 mL 黄瓜枯萎病菌悬浮液，发病后再于黄瓜幼苗植株根部分别灌入一定浓度的植物提取物5 mL，以清水处理为对照。每处理30 株，3次重复，7 d 后进行病情调查。

诱导抗病效果测定：在黄瓜幼苗叶面均匀喷施一定浓度的植物提取物，对照喷施清水，24 h后每株幼苗定量灌注5 mL 黄瓜枯萎病菌悬浮液。每处理30 株，3 次重复，待空白对照充分发病后进行病情调查。

黄瓜枯萎病分级标准（马丽娟 等，2008）如下。

0 级，全株无病；1 级，发病轻微，全株有1/4 以下的叶片出现萎蔫状；2 级，发病较重，全株有1/4～1/2 的叶片出现萎蔫状；3 级，发病重，全株有1/2 以上的叶片出现萎蔫状；4 级，因病枯死或接近死亡。

病情指数=Σ（各级发病数×代表级数）/（总调查株数×4）×100

防治效果（%）=（对照平均病情指数-处理平均病情指数）/对照平均病情指数×100%

2 结果与分析

2.1 植物提取物对3 种枯萎病菌菌丝生长的抑制作用

27 种植物提取物对3 种枯萎病菌菌丝生长抑制作用见表2，当提取物浓度为0.1 g·mL-1时，供试植物样品对3 种枯萎病菌的菌丝生长均有一定的抑制作用。其中，白屈菜、藿香、肉桂、黄檗、龙葵、狼毒大戟提取物对3 种供试枯萎病菌的抑制率均可达70%以上；威灵仙、苍耳、旋覆花、防风提取物对黄瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌的抑制效果较好，抑制率达50%以上，但对西瓜枯萎病菌的抑制效果较差（除威灵仙外）；毛茛提取物对黄瓜枯萎病菌的抑制率为50.40%，白头翁和萹蓄提取物对西瓜枯萎病菌的抑制率分别为55.70%、50.00%。其他植物提取物抑菌活性较差，抑制率均在50%以下。

2.2 室内盆栽预防效果评价

狼毒大戟、藿香、肉桂和黄檗等4 种植物的提取物对室内盆栽黄瓜幼苗枯萎病菌的预防效果见表3。

由表3 可以看出，供试的4 种植物提取物对黄瓜枯萎病菌均有一定的预防效果。其中，狼毒大戟和黄檗提取物对黄瓜幼苗枯萎病菌的预防效果最好，0.20 g·mL-1的黄檗提取物和0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物的防治效果分别高达83.33%和70.54%；肉桂提取物的预防效果也较好，当提取物浓度为0.25 g·mL-1时，防治效果达58.14%；而0.20 g·mL-1藿香提取物的预防效果较差。

另外，试验中还发现当提取物施用浓度过高时会出现烧苗现象。

2.3 室内盆栽治疗效果评价

狼毒大戟、藿香、肉桂和黄檗等4 种植物提取物对室内盆栽黄瓜幼苗枯萎病菌的治疗效果见表4。

由表4 可以看出，供试的4 种植物提取物对黄瓜枯萎病菌均有一定的治疗效果。其中，狼毒大戟和肉桂提取物对黄瓜幼苗枯萎病菌的治疗效果较好，0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物和0.25 g·mL-1的肉桂提取物的防治效果分别达57.89%和51.62%；而0.20 g·mL-1黄檗提取物和藿香提取物对黄瓜幼苗枯萎病菌的治疗效果不明显，防治效果分别为27.78%和21.04%。

2.4 室内盆栽诱导抗病效果评价

藿香、肉桂、黄檗提取物对黄瓜幼苗的诱导抗病作用效果见表5。考虑到狼毒大戟毒性较大，不宜直接叶面喷施，故未进行诱导抗病试验。

由表5 可以看出，一定浓度的藿香、肉桂、黄檗提取物均具有较好的诱导抗病作用。其中，0.40 g·mL-1藿香提取物的诱导抗病防治效果最好，高达75.60%；0.25 g·mL-1肉桂提取物和0.20 g·mL-1黄檗提取物的诱导抗病防治效果可达50%以上。

表2 植物提取物对3 种瓜类枯萎病菌菌丝生长的抑制作用

表3 植物提取物对黄瓜枯萎病菌的预防效果

表4 植物提取物对黄瓜枯萎病菌的治疗效果

3 结论与讨论

表5 植物提取物对黄瓜幼苗的诱导抗病效果

植物体内的次生代谢物质在长期的进化过程中已经形成了固定的参与能量和物质循环的代谢途径，在实际使用当中，不易产生残留及生物富集现象。目前国内外的研究都普遍认为，植物源农药对非靶标生物相对安全，比如印楝素对家兔、野鸭、七星瓢虫、蜜蜂、鸟类等都仅具有很低的毒性（赵善欢，2000；吴钜文和陈建峰，2002），因此开发利用植物源农药用于生物防治的前景十分广阔。

本试验结果表明，供试27 种植物乙醇提取物对3 种瓜类枯萎病菌均有不同程度的抑制作用，其中狼毒大戟、白屈菜、藿香、肉桂、黄檗、龙葵等对3 种供试枯萎病菌的菌丝生长具有明显的抑制效果，抑制率均在70%以上，值得作为植物源杀菌剂进一步研究。同时，本试验对狼毒大戟、藿香、肉桂、黄檗4 种植物的提取物进行了预防性、治疗性和诱导抗病性的活体盆栽试验。结果表明，0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物对黄瓜幼苗抗枯萎病菌的预防效果和治疗效果均较好，分别可达70.54%和57.89%；0.25 g·mL-1的肉桂提取物对黄瓜幼苗抗枯萎病菌的预防作用、诱导抗病作用、治疗作用的效果均可达50%以上；而对于藿香提取物来说，诱导抗病效果最佳，而预防作用和治疗作用效果不明显；0.20 g·mL-1黄檗提取物的预防效果高达83.33%，诱导抗病防治效果也可达55.55%，但治疗作用效果不明显。另外，试验中也发现当植物提取物施用浓度过高时会出现烧苗现象。

由于植物源抑菌活性成分为植物的一类或几类次生代谢物质，活性物质化学成分复杂、绝大多数没有明确；活性物质的种类、含量受自身遗传因子、外界环境条件的影响，会有地域性和季节性变化，并且活性成分在植物不同部位含量亦不同，使活性成分的含量和活性强度不稳定（邵云东 等，2003；石志红 等，2004）。因此，今后应重点针对目标病害进行植物源高抗菌活性化合物的深入筛选，发掘具有杀菌或抑菌活性的植物资源；根据生物防治原理，从植物中分离天然抑菌活性物质，应用活性跟踪法确定高效提取抑菌活性物质的关键技术与工艺路线；并在活性追踪指导下对重要植物的抑菌活性成分进行分离、结构阐明以及构效关系的研究，发现生理活性先导化合物或活性成分，为新型植物源杀菌剂开发提供先导化合物。

李瑞，周立刚，王敬国，李晓林，唐静，谢敏．2006．苦豆子提取物对黄瓜和番茄病原菌的抑制作用．西北植物学报，26（3）：558-563．

马丽娟，周宝利，张淑红，付亚文．2008．蛇床子提取物对黄瓜枯萎病菌抑制效果的研究．植物保护，34（4）：36-39．

孟昭礼，吴献忠，高庆霄，魏华．1995．银杏提取液对四种植物病原菌的抑制作用．植物病理学报，25（4）：357-360．

孟昭礼，罗兰，袁忠林，李建强，曲宝涵，姜学东，刘西莉．2002．人工模拟的植物源杀菌剂银泰防止番茄3 种病害研究．中国农业科学，35（7）：863-866．

乔康，姬小雪．2009．植物源杀菌剂研究进展．农药研究与应用，13（4）：15-19．

邵云东，高文远，刘丹，贾伟，段宏泉，张铁军．2003．植物提取物的质量控制．中国中药杂志，28（10）：899-903．

石志红，何建涛，常文保．2004．中药指纹图谱技术．大学化学，19（1）：33-39．

吴钜文，陈建峰．2002．植物源农药及其安全性．植物保护，28（4）：40．

于平儒，邵军红，冯俊涛，祝木金，张兴．2001．62 种植物样品对菌丝活性的测定．西北农林科技大学学报：自然科学版，29（6）：65-69．

赵成爱，孙辉，王呈玉，周正辉．2010．6 种中草药水提物对黄瓜黑星病菌抑制活性的室内筛选．农药，49（6）：453-455．

赵善欢．2000．植物化学保护．3 版．北京：中国农业出版社：303．