非综合征型遗传性聋研究现状及思考＊

冯永 王鸿涵

研究表明，先天性聋群体中半数以上的患者是由遗传因素导致的，其中非综合征型聋约占70%，综合征型聋约占30%［1］。遗传性聋一般表现为中重度或重度感音神经性聋，为患者带来严重的交流障碍，也为家庭和国家带来了十分沉重的负担，所以遗传性聋一直是人们关注和研究的焦点。

随着人类基因组计划的完成，信息技术变得空前发达，生物技术也进入了一个高速发展的时代，非综合征型遗传性聋相关基因研究也取得了长足进展。一方面，遗传性聋具有高度的遗传异质性，在过去的十余年中人们克隆了大量耳聋致病基因，并在这些基因中鉴定了1 000 多个致病位点。另一方面，分子流行病学调查显示大多数遗传性聋是为数不多的几个基因的热点突变导致的，这使得基因筛查的开展具有了针对性。尽管如此，遗传性聋的治疗仍是一个世界性的难题，目前对其病因仍然缺乏有效的治疗手段。本文将对非综合征型遗传性聋的基础研究及其临床应用引发的思考总结如下。

1 非综合征型遗传性聋的基础研究

1.1 致病基因的定位和鉴定 自1997年报道第一个非综合征型遗传性聋基因以来［2］，到2011年10月为止共定位了149个非综合征型遗传性聋基因座位，成功鉴定出致病基因62个（http：／／hereditaryhearingloss.org）。耳聋致病基因不仅涉及到编码细胞间连接蛋白、细胞骨架蛋白、细胞外基质蛋白、转录因子等的核基因，还包括线粒体基因及一些功能未知的基因。

在我国，夏家辉院士于1998年克隆了国内第一个耳聋致病基因——GJB3［3］，填补了我国本土遗传性疾病基因克隆工作的空白，2002年该课题组采用全基因组扫描技术对另外一个五代遗传性聋大家系进行研究并定位了一个新的遗传性聋基因位点DFNA42［4］。我国其它课题组科研工作者在耳聋相关致病基因的定位和鉴定方面也做出了贡献，定位的遗传性聋位点有 DFNA39［5］、DFNY1［6］、AUNX1［7］、DFN2［8］和DFNA64［9］，其中DFN2 和DFNA64的责任基因已分别被鉴定为PRPS1 和DIABLO。

我国人口众多，具有大量的遗传性聋家系和散发病例，然而在我国本土定位或鉴定的耳聋致病基因却很少。目前，我国仍有大量耳聋家系或散发病例的致病基因没有被找到，我们应该充分利用我国的遗传资源优势，争取鉴定出更多的耳聋致病基因。

致病基因鉴定的常用方法主要有功能鉴定、位置鉴定、候选基因鉴定和位置候选基因鉴定等，其中位置候选基因鉴定法是基因克隆的主要手段和方法，它首先通过连锁分析将致病基因定位在一个区间内，再根据生物信息学及基因功能等确定候选基因并进行突变检测来鉴定致病基因，过去十余年中这种方法在鉴定致病基因方面发挥了很大的作用。但是，该方法也有局限性，连锁分析依赖高质量的家系，并且要求家系的遗传背景单纯，另外，它只能把致病基因定位到某一段区间内，定位的区间常常包含百余个基因，定位后仍然不能够确定致病基因，导致了只能定位而无法鉴定的尴尬局面，这也常常会使基因的鉴定工作陷入困境。近两年被广泛应用的外显子组测序技术（exome sequencmg）显示了较好的应用前景［10～14］，外显子组测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，它只对大约1%的全基因组序列测序，所以更加高效、经济，数据分析起来也相对容易。目前这一新技术在耳聋致病基因的研究方面也有所应用［15］，这将会为致病基因鉴定工作提供一条新的途径。

1.2 致病基因的功能研究 随着分子生物学研究的不断深入，被鉴定的新致病基因的功能研究显得越来越重要，基因功能研究也是后基因组时代的主要内容。

传统意义上的基因功能研究一般要从分子、细胞、个体等层面进行研究，根据研究数据进行综合分析，最终获得基因功能。

从不同层面研究新发现的致病基因功能之前，首先可以利用生物信息学（bioinformatics）资源对其进行功能分析，为实验设计提供参考和指导。生物信息学综合了计算机科学、信息技术、统计学和应用数学等内容，对获得的原始信息进行存储、管理、注释、加工，其研究重点主要体现在基因组学（genomics）和蛋白质组学（proteomics）两方面，最基本的内容包括核苷酸和蛋白质序列数据库。目前，常用的核苷酸序列数据库是美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的Gen Bank 数据库（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／），该数据库中的DNA 序列总量已超过70亿碱基对，并且仍然以惊人的速度增长。Gen Bank 数据库与欧洲生物信息学研究所（The European Bioinformatics Institute，EBI）的EMBL（European Molecular Biology Laboratory）数据库（http：／／www.ebi.ac.uk／embl／）和日本国家遗传学研究所（National Institute of Genetics，NIG））的DDBJ（DNA Data Bank of Japan）数据库是目前最著名的三大核苷酸序列数据库，这三大数据库之间每天交换数据以实现各自数据的实时更新与同步。国际上著名的蛋白质序列数据库有由瑞士生物信息研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）和EBI共同维护的SWISS－PROT 数据库（http：／／www.ebi.ac.uk／uniprot／）以及由美国生物医学基金会（National Biomedical Research Foundation，NBRF）创建的PIR（Protein Information Resource）数据库（http：／／pir.georgetown.edu／）。生物信息学的研究方向包括基因识别、比较基因组学、基因表达、基因重组、蛋白质结构预测、蛋白质反应的预测以及进化模型等诸多方面的内容，目前生物信息学已经发展成为了自然科学的核心内容之一，形形色色的数据库已经有近千种，并且大部分的数据库都是免费的，应当抓住时机，运用好这些资源。

在分子层面，一般需要首先从mRNA 和蛋白两个水平对其的表达情况进行检测，前者主要涉及到的检测方法有半定量逆转录聚合酶链式扩增反应（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）、实时定量RT－PCR 和原位杂交（in situ hybridization，ISH）等技术，而后者主要使用蛋白质印迹（western blot，WB）、酶联免疫吸附试验（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫组化（immunohistochemistry，IHC）和免疫荧光（immunofluorescence）等技术。PCR 是特定的DNA 片段在特定引物和DNA 聚合酶作用下实现体外克隆的一种方法。RT－PCR 是将RNA 的逆转录和cDNA 的聚合酶链式扩增反应相结合的技术。半定量RT－PCR 具有简单、快速、经济等优点，但是其定量的精准度不高，而荧光定量RTPCR精准度高，特异性更强、可以实现高通量，但是相对来说成本较高。ISH 是指将特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定位和定量的一种方法。它具有高度的灵敏性和准确性，在基因的定位方面具有优势，被广泛应用于基因表达图谱的构建等研究领域，目前在临床诊断方面也有所应用。蛋白的表达检测多运用抗原抗体特异性结合的原理，通过抗体的显色来分析蛋白的表达情况。WB是研究蛋白表达的最常用手段之一，可以依据其着色强度得知蛋白量的表达，还可以根据着色位置来确定蛋白的分子量，分子量的大小也可以在一定程度上反映蛋白有无异常，如果基因出现截短突变其表达的蛋白的分子量就会变小。ELISA 主要用于检测液体物质（诸如血清）中的蛋白表达情况。IHC主要用于细胞或组织中蛋白的定位情况。免疫荧光也称荧光抗体技术，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位，它具有高度的特异性和敏感性，但是其判断标准缺乏客观性，定量方面欠精准。

在细胞水平，运用各种载体将目的基因（野生型或者构建的突变体）导入某一细胞系中来观察其在细胞中的表达情况及细胞的生物学行为来了解基因功能。同样可以用上述分子层面研究方法检测基因或蛋白在细胞系中的表达情况。还可以在细胞模型上检测蛋白质相互作用，常用技术有免疫共沉淀（co－immunoprecipitation，Co－IP）、酵母双杂交系统（yeast two－hybrid system）及蛋白芯片（protein array）等技术。Co－IP 是利用抗体和抗原之间的特异性作用，用于研究蛋白质相互作用的经典方法之一，它模拟体内试验的环境，避免人为因素干扰，以测定两种目标蛋白质在自然状态下是否结合，反映出来的结果更加可靠真实。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用，该方法灵敏度高，可以检测到极其微弱或瞬时的蛋白间的相互作用。蛋白芯片类似于基因芯片，是将蛋白质点到芯片上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。它是一种高通量检测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来检测蛋白分子之间的相互作用。激酶活性和泛素化活性研究等可以用来检测基因的生物学活性改变。

体外实验研究往往不能够完全真实地反映基因或者蛋白质在体内的生物学行为，而模式生物学已经成为在体验证基因功能必然的选择，其中以小鼠为模型的研究有可能帮助人们揭开人类遗传性聋的谜底，因为小鼠和人类的内耳在解剖、生理等方面都有许多的相似性，并且小鼠和人类的基因组具有高度的同源性，在很大程度上表现为相似的功能，这使得小鼠模型成为鉴定哺乳动物和人类致病基因的常用工具。

基因功能的研究也在试图突破传统的单基因研究模式，主张从整体水平认识基因功能，不但研究某一个基因，还研究基因的表达调控、修饰基因的影响作用、基因间的相互作用等，最终在一个复杂的基因网络中认识基因的功能。基因功能研究是探讨致病基因发病机制以及从病因上解决遗传性聋这一难题的必经阶段，也是以后基因治疗能够应用于临床的理论依据。

1.3 基因治疗研究及难题 基因治疗是指将外源性正常基因导入靶细胞，用来纠正或补偿缺陷或异常基因丧失的功能，以达到治疗疾病的目的。基因治疗的可行性已经在动物模型上得到了验证，但是其安全性方面仍存在许多严重的问题，目前它仍处于实验医学阶段。

过去10余年来，基因治疗在遗传性聋方面的基础研究得到了广泛地开展，其研究内容主要涉及到基因载体、导入途径、外源性基因及其作用靶点［16］。安全有效的基因载体对基因治疗至关重要，目前所用的载体分为病毒性载体和非病毒性载体，一般认为非病毒性载体较病毒性载体更为安全，因为病毒性载体具有免疫原性、致癌性等缺点，而较低的转染效率却限制了非病毒性载体的应用。内耳基因导入途径主要包括圆窗膜途径、鼓阶途径、半规管途径、脑脊液途径和内淋巴囊途径等，这些导入途径大多数有一定的创伤性，会损伤内耳功能。而完整的圆窗膜途径被认为最有发展前景，此途径不仅对内耳损伤较小，还可以大大提高载体的转染效能。而外源性基因方面主要解决导入基因的可控性问题，使其不至于不当表达而引起机体损伤。

2 非综合征型遗传性聋临床检测及干预

2.1 致病基因的常用检测方法 遗传性聋基因检测的手段主要包括直接测序、限制酶切－单链构象多态性分析、限制性片段长度多态性分析、变性高效液相色谱分析、基因芯片等，其中传统直接测序法被认为是基因突变检测的“金标准”，但是存在仪器设备昂贵、操作复杂、耗时长、花费高等缺点，最主要的一点是难以实现高通量，所以其应用受到了很大的限制。而2005年454公司首推的罗氏454测序技术，克服了传统测序方法的上述缺点，但是面对天文数字般的数据，分析起来难度较大，一时普及应用还有一定困难。相比之下，基因芯片进行突变筛查具有一定优势，目前在临床上已较为广泛的应用。耳聋致病基因的分子流行病学调查研究显示GJB2、SLC26A4、线粒体基因是导致国人遗传性聋的“明星基因”，而GJB2 235delC、SLC26A4IVS7－2A＞G、线粒体基因A1555G 是这些基因的热点致病突变［17～20］。据此，博奥公司和解放军总医院联合开发的“晶芯®遗传性聋基因芯片试剂盒”，该芯片可检测4 个耳聋相关基因GJB2、GJB3、SLC26A4 和12SrRNA 的9个突变热点［21］。目前该芯片已经应用于临床并取得了一定的成效［22］。但由于遗传性聋具有很强的遗传异质性，涉及的耳聋基因众多，仅检测少数“明星基因”的策略对耳聋基因筛查来说是远远不够的，随着生物学检测技术的发展，建立覆盖所有已知耳聋致病基因及相关疾病位点的高通量检测技术成为可能。基于此，中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科于2010年开始着手研制我国第一套高通量遗传性聋致病基因检测系统 ——Illumina Glodengate 384K 高通量基因芯片，该芯片共涵盖了41个国际上公认的耳聋致病基因的240 个突变位点（显性突变位点77个，隐性突变位点163个），同时还包含了144个单核苷酸多态性（SNPs）位点用于构建单倍体型－连锁分析而完成对耳聋家系成员的基因定位。运用此芯片对480例遗传性聋患者进行了突变检测，并对部分检测结果经过测序验证（此部分内容的数据正在进一步整理中），初步结果显示该芯片准确性高，该芯片为开放式芯片，可以根据实际需要对芯片所设计的位点进行更改，以便跟据临床需要做出适当调整，提示该芯片是目前技术条件下具有实用价值的芯片。

同时，其他的检测手段也时有应用，中南大学湘雅医院针对中国人群中相对高发的耳聋突变热点，研发了基于PCR－RFLP 技术的“耳聋基因热点突变检测试剂盒”。该试剂盒集成分子生物学中简单、廉价的技术和最新的遗传性聋研究成果，经济实用，适合于开展广泛的遗传性聋患者的基因筛查［23］。

应当指出的是目前任何一种检测方法尚不能对患者做出比较全面的基因诊断。基因诊断定义为利用现代生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及表达水平是否正常，从而对疾病进行诊断的方法。可见目前的检测方法检出能力还很有限，存在着很多的不确定因素，目前的基因检测上只能称得上是基因筛查。随着新一代测序技术和蛋白功能数据库的发展，也许在将来可以达到基因诊断的水平，但是这还有待研究者的共同努力。

2.2 遗传性聋的三级干预策略 根据基因筛查结果及临床听力学检查对遗传性聋发生的不同阶段我们提出了三级干预策略：

一级干预：对基因筛查阳性的病例实行产前干预，降低先天性聋的发病率；对特殊人群（比如SLC26A4基因突变所致的大前庭水管综合征、线粒体DNA A1555G 突变导致的药物性聋患者）及时指导干预，可以避免或延缓耳聋的发生；对已经明确致病基因的大家系进行产前干预，避免耳聋患者出生。二级干预：对出生后的新生儿进行听力筛查和基因筛查，根据检测结果选择有效的干预手段（助听器和人工耳蜗等）和言语康复，以建立有效听力言语功能。三级干预：对语后聋的患者根据听力学和基因筛查结果，同样可以采用有效的干预手段（助听器和人工耳蜗等）改善听力，以提高生活质量，而基因筛查结果则可以用于产前指导。目前，国内耳聋基因筛查对已经生育聋儿患者的家庭或有家族史的人群进行生育指导方面，已有一些成功的案例报道［24，25］，其它方面也在不断探索中。

3 结语及展望

过去近20年中，遗传性聋的研究工作取得了很大的进展，但是就目前的情况来看该领域还存在很大的研究空间，研究成果在临床上的应用仍然处于起步阶段，人们对遗传性聋的有效治疗还显得力不从心。因此，应在以下几个方面加强研究。

3.1 加强耳聋致病基因的基础研究 由于大量的耳聋责任基因没有被找到，这使得一部分患者面临找不到分子病因的困境，所以不能放松对基因克隆的研究。随着人类基因组计划的完成，生命科学进入了后基因组时代，基因功能的研究成为了科学研究的重要内容。弄清耳聋基因的功能有助于诠释听觉产生的机制，这样才可能找到听力障碍患者的问题所在，才谈得上如何解决问题。动物模型研究，特别是小鼠模型［26，27］为研究基因功能提供了很大的方便，有报道基因治疗已经能够使耳聋小鼠恢复听力［28］，这也为未来临床治愈耳聋带来了新的希望。

3.2 重视和拓展基础研究在临床上的应用 国内基因筛查的力度和规范化程度还远远不够，尚未建立起完整的体系，对高危人群缺少正确积极的遗传咨询引导。目前基因筛查工作主要针对遗传性聋患者开展，其临床应用还十分局限，应当拓展其应用范围，比如基因筛查的对象可以扩展到更大的目标人群，如果对有生育要求的夫妇进行婚前或者产前基因筛查指导其优生优育，将会避免一部分聋儿出生。

3.3 加强临床相关学科的发展 随着听力学的蓬勃发展，西方国家已经培养了一些经过系统教育和严格训练的临床听力师，在英国，这部分专业人员必须经过严格临床资格认证才能独立从业［29］。临床听力师的主要任务是配合耳科医生对耳聋患者提供临床检测、诊断、治疗、康复、教育、预防等服务［30］，医学遗传学主要研究遗传性疾病的发病规律和机制，在临床诊断、预防和治疗中已经可以发挥很大作用，应当加强医学遗传学专业队伍的建设，大力提倡遗传咨询。不同地区的医疗机构应当开放遗传咨询门诊，建立规范化、程序化的遗传咨询流程。产科和儿科等相关医务人员应普及并认识遗传咨询的重要性，加强对患者家属正确的就医指导。

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