酶催化荧光法测定盐酸肾上腺素

(周口师范学院化学系，河南周口 466001)

盐酸肾上腺素为儿茶酚胺类物质，是一类非常重要的生理学神经递质。通过检测人体肾上腺素及其代谢产物的浓度，为药物分析及临床提供参考，因此，探索快速、方便、灵敏检测盐酸肾上腺素的方法具有重要意义［1］。目前测定的方法有高效液相色谱法、荧光光度法、电化学分析法、毛细管电泳法、化学发光分析法、分光光度法等［2-7］。目前检测盐酸肾上腺素的方法虽各有其特点，但在灵敏度、特异度和检测速度等方面大多还不能满足临床疾病诊断的需要。酶促反应动力学分析法在临床、药物、农业、工业过程检测中具有广泛的应用［8］，采用酶催化荧光猝灭法分析盐酸肾上腺素还未见报道。

本文基于在碱性介质中，利用盐酸肾上腺素对血红蛋白酶催化荧光体系具有强烈的猝灭作用，建立了酶催化荧光法测定盐酸肾上腺素的新方法。方法的检出限为3.4×10-8mol/L。该法具有操作简单、灵敏度高、选择性好的特点，已成功的应用于药物制剂中盐酸肾上腺素含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JASCO FP-750型荧光光度仪，日本分光公司;pHS-3C型酸度计，上海理达仪器厂;BS210S电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司。

血红蛋白，上海伯奥生物科学有限公司、L-酪氨酸，北京化学试剂厂;H2O2溶液;NH3-NH4Cl缓冲溶液。

盐酸肾上腺素:中国药品生物制品检定所生产，准确称取0.494 0 g，用二次蒸馏水溶解配成2.2×10-2mol/L储备液(4℃冰箱保存);工作液:用二次蒸馏水逐级稀释成2.2×10-4mol/L，现配现用。

所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

在10 mL比色管中依次加入2.0 mL pH值为9.1 的 NH3-NH4Cl缓冲溶液，4.0 mL 浓度为 1.0×10-3mol/L的L-酪氨酸溶液，不同浓度的盐酸肾上腺素标准溶液，0.8 mL浓度为1.0×10-5mol/L的牛血红蛋白溶液，0.6 mL浓度为 1.0×10-3mol/L的H2O2溶液，用水定容。在室温下放置20 min后，在选定的激发波长315 nm下测定溶液的荧光强度为F，以不加盐酸肾上腺素的空白溶液为参比，同时测得空白溶液的荧光强度F0，计算荧光强度差值即荧光强度猝灭值ΔF=F0－F，以荧光强度猝灭值ΔF对盐酸肾上腺素的浓度作标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

在血红蛋白的作用下，H2O2能够氧化L-酪氨酸产生荧光二聚体。实验发现，盐酸肾上腺素对此荧光体系有强烈的猝灭作用，藉此建立了一种用荧光猝灭法测定盐酸肾上腺素的新方法。荧光光谱如图1所示，其中荧光二聚体的激发波长和发射波长分别λex=315 nm，λem=404 nm。由图1可知，盐酸肾上腺素的加入能够显著的抑制该体系的荧光强度。

图1 体系的荧光光谱

2.2 测定条件的优化

2.2.1 酸度条件的选择

溶液酸碱度对酶促反应有很大的影响，所以NH3-NH4Cl缓冲溶液的pH值要严格控制。分别考察了 pH 值为 8.3、8.6、8.9、9.1、9.5 的 NH3-NH4Cl缓冲溶液的影响，如图2所示。随着pH值的升高，盐酸肾上腺素对荧光体系的猝灭作用先增大后减小，在pH值为9.1时ΔF值最大，且体系基本恒定。因此，实验中选择pH值为9.1的NH3-NH4Cl缓冲溶液作为反应介质。

2.2.2 H2O2浓度的影响

H2O2在反应体系中作为氢受体底物，它的浓度直接影响到反应的速度和完全程度。浓度过高，盐酸肾上腺素易被氧化;浓度过低，氧化反应不完全。因此，选择H2O2的浓度为6.0×10-5mol/L。

2.2.3 L－ 酪氨酸浓度的影响

分别试验了不同浓度的L-酪氨酸对荧光体系的影响。实验证明:随着L-酪氨酸浓度的增大，荧光猝灭作用逐渐先增强后减弱。当L-酪氨酸溶液的浓度为4.0×10-4mol/L时荧光猝灭作用最大。因此，本实验选择L-酪氨酸溶液的最佳浓度为4.0×10-4mol/L。

图2 pH值的影响

2.2.4 血红蛋白浓度的影响

分别试验了不同浓度的血红蛋白对荧光体系的影响。结果表明:随着血红蛋白Hb的浓度的增大，盐酸肾上腺素对荧光体系的猝灭作用先增大再逐渐减小，当Hb的浓度为8.0×10-7mol/L时，盐酸肾上腺素对荧光体系的猝灭作用最强。本实验选择Hb的浓度为8.0×10-7mol/L。

2.2.5 反应时间的确定

研究了不同盐酸肾上腺素浓度下反应的动力学行为。随着盐酸肾上腺素浓度增大，其荧光猝灭作用也逐渐增强;同时发现，随着时间的延长，反应速度逐渐减慢，室温20 min后体系趋于稳定，因此，选择20 min作为体系的反应时间。

2.3 分析方法特性

在最佳的实验条件下，盐酸肾上腺素的浓度在1.5×10-7～2.2×10-6mol/L范围内对该体系的荧光强度猝灭值ΔF有较好的线性关系，其线性回归为:

方法检出限，经3Sb/k经验公式计算为3.4×10-8mol/L，其中Sb为空白的标准偏差，k为线性校正斜率。对浓度为1.2×10-6mol/L的盐酸肾上腺素进行11次平行测定的相对标准偏差为2.7%，表明该方法有较好的重现性和较高的精密度。

表1 不同测定盐酸肾上腺素方法的比较

将本法与其它用于测定盐酸异丙嗪的方法进行比较(见表1)，本法具有较高的灵敏度。

2.4 共存物质的影响

按试验方法虽浓度为1.2×10-6mol/L的盐酸肾上腺素标准溶液进行干扰试验，当相对标准误差不大于±5.0%时，下列离子不干扰测定(以mol/L计):Na+、Cl-、F-、K+、NO-3、CO2-3、葡萄糖、淀粉、硬脂酸钠(1 000)，EDTA、PO3-4、抗坏血酸(500)，Ca2+、OH-、Cu2+、Mg2+(100)，Fe3+(10)。

2.5 样品分析

表3 盐酸肾上腺素注射液分析结果(n=5)

将不同批号的盐酸肾上腺素注射液适当稀释后按实验方法进行测定，同时进行加标回收试验，结果见表3。从表中可以看出，加标回收率为94.5% ～105.4%，结果满意。

［1］刘 诚，黄 俊，肖海燕.肾上腺素的检测进展［J］.传感器与微系统，2006，25(11):1-4.

［2］陈福南，张迎雪，章竹君，等.高效液相色谱化学发光检测人体血清及尿样中的盐酸肾上腺素［J］.分析化学，2005，33(12):1771-1774.

［3］代 璞，陈 钢，张 晓，等.肾上腺素和去甲肾上腺素的一种荧光测定法［J］.华中师范大学学报:自然科学版，1996，30(1):199-202.

［4］周元臻，郑建斌.肾上腺素的示波极谱行为及测定［J］.理化检验(化学分册)，2008，44(10):937-939.

［5］T S Zhou，H Qin Y Z Hui.Separation and determination of β-agonists in serum by capillary zone electrophoresis with amperometric detection ［J］.Analytica Chimica Acta，2001，441:23-28.

［6］G J Zhou，G F Zhang，H Y Chen.Development of integrated chemiluminescence flow sensor for the determination of adrenaline and isoprenaline［J］.Analytica Chimica Acta，2002，463(2):257-263.

［7］K A Loay，M Anas，Al-Abachi.Flow injection spectrophotometric determination of some catecholamine drugs in pharmaceutical preparations via oxidative coupling reaction with ptoluidine and sodium periodate［J］.Analytica Chimica Acta，2005，538(1-2):331-335.

［8］E H HANSEN.Flow-injection enzymatic assays［J］.A-nal Chim Acta，1989，216(1):257-273.