人参皂甙Rg1对昆明小鼠早胚体外发育的影响

林翠英 叶维建 陈建明 姜雨飞 张燕琴 王世鄂＊

（莆田学院医学院 福建351100；1福建医科大学人体解剖学与组织胚胎学系生殖医学中心，福州350004）

多数品系小鼠（如KM、CF-1等）早胚体外发育易出现“2-细胞阻滞现象”，即在离体培养条件下，小鼠受精卵（合子）经一次分裂后，大多数停滞于2-细胞时期，很少能发育至桑葚胚或囊胚。有研究表明，线粒体超微结构缺陷可引起线粒体氧化磷酸化水平异常，导致线粒体代谢水平与胞质内局部能量需求不协调，从而引发早胚发育阻滞或异常［1］。前期研究也表明，2-细胞胚内线粒体功能低下是昆明（Kunming，KM）小鼠早胚体外培养出现2-细胞阻滞的重要原因［2］。近年来研究显示，人参皂甙（Ginsenoside，Rg1）具有神经营养和神经保护作用，可能与其对细胞内线粒体活性保护和抑制凋亡作用有关［3，4］。此外，人参皂甙 Rg1可改善快速老化小鼠线粒体结构和功能障碍［5］。因此，本研究在M16培养液中添加人参皂甙Rg1，观察其对KM小鼠早胚体外发育的影响，为进一步探讨人参皂甙Rg1在小鼠早胚体外发育中的作用和机制提供实验依据。

材料和方法

1.材 料

1.1 实验动物

KM小鼠购自上海斯莱克公司（雌鼠4-6周，雄鼠8周以上）。继续饲养3-5d，调节生理周期，使其适应环境供实验处理。

1.2 主要试剂和仪器

孕马血清促性腺激素（PMSG）（ProSpec TechnoGene），人绒毛膜促性腺激素（hCG）（sigma），M2和 M16（sigma），倒置显微镜（Nikon），水套式二氧化碳培养箱（力康）。

2.方 法

小鼠早胚体外培养 KM雌鼠腹腔注射5 IU PMSG，46-48h后注射5IU hCG，随后与KM 雄鼠1∶1合笼。次晨检查雌鼠阴栓，判断是否受精。在注射hCG后28h从有阴栓雌鼠输卵管中收集1-细胞胚，经M2洗涤，M16漂洗3次，将形态完好的1－细胞胚移至预孵育好的M16培养液滴（其中分别含 0μmol／L、5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L 的Rg1）中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中连续培养，每天观察和记录早胚发育情况，重复3次以上。

3.统 计学处理

由于各组从1－细胞胚体外培养到2－细胞胚的发育比率无明显差别，为了排除卵母细胞未受精引起的发育差异，各组发育情况均采用以2-细胞胚数目为底计算百分率。用SPSS 13.0统计软件分析，均以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

KM小鼠1－细胞胚分别在未添加和添加不同浓度Rg1的M16培养液中连续培养观察，结果发现：KM小鼠1-细胞胚经M16培养液培养很少能发育至桑葚胚，只有极个别发育到囊胚；添加浓度为5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L的 Rg1的 M16培养液能明显提高KM小鼠1-细胞胚发育至桑葚胚的比率，而添加浓度为10μmol／L的Rg1的M16培养液能明显提高KM小鼠1-细胞胚发育至囊胚的比率（表1，图1、2）。

表1 Rg1对KM小鼠1－细胞胚体外发育的影响Table 1 Effect of Rg1on the development of KM mouse one-cell embryos in vitro

讨 论

很多研究认为哺乳动物早胚体外发育阻滞或合子基因组激活延迟可能与细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）增多有关。将牛早胚置于高氧压（20%O2）条件下培养，牛胚胎基因组激活明显延迟或受抑［6］。然而有的学者却认为ROS除了具有细胞毒性作用，其实还参与细胞正常的生理过程，如细胞的增殖、分化、凋亡和细胞信号转导过程［7，8］。前期分别比较阻滞品系KM小鼠（♀KM╳♂KM）体内发育与体外培养所得2－细胞胚内ROS水平，以及KM小鼠（♀KM╳♂KM）与非阻滞品系B6C3F1小鼠（♀B6C3F1╳♂B6C3F1）体外培养2-细胞胚内ROS水平，结果显示KM小鼠（♀KM╳♂KM）体外培养2-细胞胚内的ROS水平显著低于体内发育，也低于体外发育B6C3F1（♀B6C3F1╳♂B6C3F1）小鼠2-细胞胚内的ROS水平。这些结果提示在正常培养条件下，胚内ROS水平适度升高有利于早胚发育［2，9］，由于线粒体是需氧生物ATP合成的主要场所，而线粒体呼吸链电子漏同时也是机体ROS产生的重要来源［10］。因此，前期进一步比较KM小鼠和B6C3F1小鼠体外培养的2－细胞胚内线粒体膜电位水平和ATP的含量，结果表明KM小鼠2－细胞胚线粒体功能明显比B6C3F1小鼠的低下，提示2－细胞胚内线粒体功能低下是KM小鼠早胚体外培养出现2－细胞阻滞的重要原因［2］。

人参皂甙Rg1作为三七总皂甙中含量最高的单体，对神经系统有广泛的生物学作用，对认知功能障碍有改善作用，可以提高神经可塑性，激活学习记忆信号转导途径，促进海马神经元发生，还具有神经保护和促进神经修复、诱导神经干细胞分化等作用［3，4，11，12］。有研究表明，脑缺血再灌注后人参皂甙Rg1能明显改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能、降低脑梗死体积及减轻脑水肿程度。同时，人参皂甙Rg1能明显地减轻线粒体损伤，对缺血再灌注造成的线粒体ATP酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶 及 超 氧 化 物 歧 化 酶 （superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性的降低有明显的上调作用，降低丙二醛的含量［13］。Korivi等研究显示人参皂甙Rg1明显增高运动疲劳性大鼠肝内谷胱甘肽水平，增强SOD、过氧化氢酶和GSH-Px活性，同时能抑制运动疲劳性大鼠肝内黄嘌呤氧化酶活性和降低一氧化氮水平，减少自由基对肝脏的氧化损伤［14］。又有研究表明，人参皂甙Rg1能够改善快速老化小鼠的线粒体功能异常及其结构损伤，表现为提高线粒体膜电位，改善线粒体氧化还原能力，减轻线粒体膜肿胀程度［5］。因此，本研究选择人参皂甙Rg1作为添加剂，添加不同浓度人参皂甙Rg1至M16培养液中，观察人参皂甙Rg1对昆明小鼠早胚发育的影响，结果表明，添加浓度为5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L的Rg1的M16培养液能明显提高KM小鼠1-细胞胚发育至桑葚胚的比例，而添加浓度为10μmol／L的Rg1的M16培养液能明显提高KM小鼠1－细胞胚发育至囊胚的比例。这是否与人参皂甙Rg1具有抗氧化和改善线粒体功能、维持线粒体膜的完整性有关，有待于进一步研究。

此外，Chan等研究认为人参皂甙Rg1具有类雌激素活性，应定义为一种新型的植物雌激素［15］。人参皂甙Rg1能不依赖配体激活的雌激素受体α（Estrogen receptor alpha，ERα）途径，而是通过快速诱导ERα转录激活功能域-1（activation function-1，AF-1）的丝氨酸118残基的磷酸化，发挥类雌激素活性［16］。那么，人参皂甙Rg1促进KM小鼠早胚体外发育是否仅与其发挥类雌激素活性有关，还是人参皂甙Rg1发挥类雌激素作用，达到抗氧化改善线粒体功能和维持线粒体膜完整性等生理效应，从而有利于早胚体外发育。其详细作用机制，需要进一步研究阐明。

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图 版 说 明

图1 在M16培养液中培养的KM小鼠不同发育阶段早胚（bar＝100μm）1A、注射hCG后64h；1B、注射hCG后80h；1C、注射hCG后112h

图2 在添加10μmol／L Rg1的 M16培养液中培养的KM小鼠不同发育阶段早胚（bar＝100μm）2A、注射hCG后64h；2B、注射hCG后80h；2C、注射hCG后112h

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Different stages of KM early embryos cultured in M16 medium （bar＝100μm）1A.Post-hCG 64h；1B.Post-hCG 80h；1C.PosthCG 112h

Fig.2Different stages of KM early embryos cultured in M16 medium with 10μmol／L Rg1（bar＝100μm）2A.Post-hCG 64h；2B.Post-hCG 80h；2C.PosthCG 112h