番茄抗溃疡病品种的转育与SSR鉴定

李燕凌，张 文，张新宇，李大志

（1.湖南省蔬菜研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128）

番茄溃疡病（bacterial canker of tomato）是由密歇根棒形杆菌密歇根亚种（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）引起的一种毁灭性细菌病害。该病害自从1909年首次在美国温室番茄上发现以来，发生频繁，主要通过带菌种子和种苗远距离传播，现已广泛分布于世界各番茄产区，我国于1985年首次在北京市发现番茄溃疡病并报道。我国已成为世界上最重要的番茄制种基地之一，随着国际间日益频繁的种质交换和种子贸易，近年来番茄溃疡病成为我国番茄生产的巨大潜在威胁。湖南高温高湿的气候条件更适宜于病害的流行，该病害一般于5～7月发生，湖南城步县等高山地区主要在7～8月爆发[1]，严重发病的地区番茄减产达25%～75%。目前，生产上还没有快速有效的防治办法，但番茄溃疡病的快速检测和鉴定已有大量研究[2-7]。

几十年来，生产上对番茄溃疡病采用过化学防治、生物防治和农业措施防治，但均收效甚微，抗病育种或许是彻底根治该病害的最佳途径。国内外的专家大多采用常规手段进行抗病育种，从本属或近缘属作物中寻找抗性资源，这样可以尽快育出抗病品种。龙葵（Solanum.nigrum L）与番茄同属茄科茄属，是湖南地区普遍生长的一种野草，湖南省蔬菜研究所课题组前期对龙葵进行了调查以及病原菌接种鉴定，研究表明龙葵对番茄溃疡病高抗。笔者以感病番茄98-1为母本、茄科茄属龙葵为父本进行杂交育种，进行了四代回交和一代自交及SSR鉴定，以期获得对番茄溃疡病具有抗性的杂交后代群体及与番茄溃疡病抗性相关的SSR标记。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 母本：番茄98-1，从台湾引进，定植于湖南省蔬菜研究所；父本：龙葵，从野外采集，定植于湖南省蔬菜研究所示范园。

1.1.2 引物序列 从http://www.gramene.org和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站获得110对SSR引物信息，由北京鼎国生物有限公司合成。试验所采用的引物序列信息如表1所示。

表1 部分SSR引物序列

1.2 方法

1.2.1 番茄育种 用番茄98-1作轮回亲本，四代回交，再自交一代。2007年4月在龙葵开花前采集花粉，对其进行干燥和保存；5月在番茄花药成熟但花朵未开放时，进行去雄并授以龙葵花粉，然后套袋；7月收种后立即播种，然后用番茄98-1作轮回父本和F1（98-1×龙葵）。2008年、2009年共回交四代，2010年自交一代，选取1 000份生长健壮、植物学形态较好的材料进行SSR鉴定和病理学接种鉴定。育种技术路线如图1所示。

图1 番茄育种技术路线

1.2.2 总DNA的提取及浓度检测 在植株上直接取叶子，用简化的CTAB法[8]提取总DNA。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度，用微量紫外分光光度仪测（ND-1000）检测所提取DNA的浓度。

1.2.3 PCR扩增 以提取的总DNA为模板，进行PCR 扩增，反应体系：10×Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 引物 1 μL，模板DNA 20 ng，Taq DNA polymerase 1U，补充 ddH2O至 25 μL。反应条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 采用1×TAE（Tris-冰乙酸-EDTA，pH值8.0）电泳缓冲液，用1.0%的琼脂糖凝胶作为载体，以λDNA/HindⅢ为Marker，每孔点 6 μL（DNA 5 μL，溴酚兰 1 μL），在 100 V 电压，70 mA电流条件下电泳1 h，EB（溴化乙锭）染色20 min，将凝胶置于凝胶成像系统中拍照。

1.2.5 抗病鉴定 （1）田间接种鉴定：菌种来源于湖南省植物保护研究所，接种室选于封闭的玻璃温室，接种的植株用纱网隔离。（2）SSR鉴定：每回交一代进行鉴定，从BC4I1的不同株系中选出1 000株高抗的单株，从叶中提取DNA，以98-1作对照，进行PCR扩增，琼脂糖电泳检测，寻找差异带。

1.2.6 抗病材料的获得 2008年春在湖南省蔬菜研究所日光温室播种BC1代，进行了分子标记辅助选择和抗病鉴定，选中25株植株分别进行回交并单株收种，BC2、BC3只进行田间接种鉴定，按株系收取高抗植株。2010年春将BC4播种于日光温室大棚，进行SSR抗病鉴定，同时进行自交，从不同的株系中选出抗病且性状好的单株取样并留种。

2 结果与分析

2.1 具有抗性的杂交后代群体及其基因相关标记的获得

利用SSR标记对亲本和105个BC1群体进行筛选，最终获得1个与龙葵抗溃疡病基因相关的标记—CAT01（上游序列:GCTTTCGATCCCTCCACATA，下游序列：GATCCCTACAATCCTTGGTCC），扩增片段大小为810 bp左右（图2），其中25株杂种后代含有该标记。利用该25株子代与母本进行回交，通过接种溃疡病菌，田间抗病鉴定筛选出5株抗病的单株，后陆续进行3次回交得到BC2、BC3和BC4群体。在BC4不同的株系中选出1 000株含有标记的植株，从这些植株中筛选出80株性状好的单株进行抗病性鉴定与自交，最终得到34个抗病且性状优良的株系。如图3所示，对BC1群体中34株进行SSR分子标记筛选，样品中有8株扩增出与抗性相关的条带，分别位于第1、5、9、10、11、13、18、20 泳道，都是复合带，说明母本里也含有抗性基因，可能是没有表达的隐性基因。

2.2 转育过程中抗病反应及农艺性状的变化

2.2.1 抗病反应的变化 对杂交后代接种番茄溃疡病菌，观察发现BC1、BC2代表现为中感，有番茄溃疡病的典型病斑。但到了BC4代，部分植株表现为中抗和高抗，在接种处出现过敏性反应症状，接近龙葵对溃疡病的抗性。

2.2.2 果形的变化 BC1代时果形还主要接近龙葵，BC3代开始接近番茄，但是也有龙葵型的，BC4代的果型已经接近回交亲本98-1，近小番茄。

2.2.3 植株高度的变化 BC1、BC2植株接近龙葵，高约60 cm，BC4开始大幅度增高，植株高度接近番茄。

3 讨论与结论

通过远缘杂交可以将龙葵对溃疡病的抗性介导给番茄，为防治番茄溃疡病害提供了参考。通过分子标记辅助选择，可以更准确、更省力的选择目标性状，尤其是多基因控制的性状。该研究以感病番茄98-1为母本、茄科茄属龙葵为父本进行杂交育种，经过四代回交和一代自交，获得了对番茄溃疡病具有抗性的杂交后代群体，并得到了1个与番茄溃疡病抗性相关的SSR标记—CAT01。

经过几年转育，研究发现番茄抗溃疡基因是由多基因控制的，SSR分子标记只代表其1个基因的某个片段或与其中1个抗病基因连锁的片段，但没有该标记一定不具备抗性。因此，在后代中大量淘汰没有该标记的单株，可减少研究者的工作量，再通过田间鉴定确定真实抗病的单株，自交纯化获得高抗植株。

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