奥曲肽联合多西他赛对胃癌细胞抑制作用的研究

申 申

辽宁医学院附属第二医院，辽宁锦州 121000

临床和基础研究均表明生长抑素类似物奥曲肽（OTC）不仅能抑制多种内分泌激素分泌，而且对多种肿瘤生长也具有抑制作用，可作为联合用药方案的基础。 多西他赛(DOC)为紫杉醇类抗肿瘤药物，单药或联合其它化疗药在进展期胃癌的治疗中已显示了较明显的优势。 现应用奥曲肽联合多西他赛干预胃癌细胞生长，验证奥曲肽对多西他赛是否有增敏作用。

1 材料与方法

1.1 材料与实验试剂

SGC-7901，多西他赛(20 mg，0.5 mL )，生长抑素类似物奥曲肽，胎牛血清，RPMI.1640 干粉培养基，胰酶，四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，碘化丙啶（PI），33258 荧光染料。

1.2 试验方法

1.2.1 奥曲肽、 多西他赛及联合用药对胃癌细胞增殖的影响 该实验设计奥曲肽药物分组浓度为1、5、20 ng/ mL; 多西他赛浓度为1、5、10、20、40 ug/mL。 取对数生长期的人胃癌SGC-7901 细胞，胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/ mL，每孔种200 uL 细胞悬液于96 孔培养板内，同时设立细胞对照组、奥曲肽处理组（1、5、20ng/mL）、多西他赛处理组（1、5、10、20、40 μg/mL）、联合用药组（奥曲肽+多西他赛1ng/mL+1μg/mL、1 g/mL+5 μg/mL、1 ng/mL+10 μg/mL、1 ng/mL+20 μg/mL、1ng/mL+40 μg/mL、5 ng/mL+1μg/mL、5 ng/mL+5 μg/mL、5 ng/mL+10 μg/mL、5 ng/mL+20 μg/mL、5 ng/mL+40 μg/mL 、20 ng/mL+1 μg/mL、20 ng/mL+5 μg/mL、20 ng/mL+10 ng/mL、20 ng/mL+20 μg/mL、20 ng/mL+40 μg/mL）每组设8 个复孔。置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养。于48 h 后取出96 孔板，2000 rpm 离心10 min， 超净工作台无菌条件下弃去上清，加200 uL/孔RPMI.1640 培养液及20 ul/孔MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h， 取出后2000 rpm 离心10 min， 弃去上清液， 加150 uL/孔DMSO 震荡10 min 混匀，待溶解完全后酶标仪比色，波长570 nm。计算各组浓度抑制率。

1.2.2 流式细胞术分析细胞周期 根据MTT 比色法分析实验结果取抑制率最高浓度组，设立不加药对照组、奥曲肽20 ng/mL组、多西他赛40 μg/mL 组、联合用药奥曲肽20 ng/mL+多西他赛40 μg/mL 组，以胰蛋白酶消化对数生长期的SGC-7901 细胞，将细胞收集到含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，调整细胞数为105/mL，取2 mL 细胞种于6 孔板孔内培养24 h，后分别以预设药物处理细胞24 h，1500 rpm 离心5 min 弃上清，再用PBS 洗两次， 离心弃上清，PBS 悬浮细胞， 缓慢滴加70%冷乙醇边滴加边旋搅防止细胞结块成团，于－20℃固定至少24 h，而后离心弃乙醇，用PBS 洗去乙醇，离心弃上清，1 mL PI 荧光染料孵育30 min，采用流式细胞仪，进行检测。 重复3 次。

1.2.3 Hoechest33258 荧光染色检测 取普通洁净盖玻片于浓硫酸-重铬酸钾清洁液中浸泡过夜，自来水洗涤5 遍，蒸馏水冲洗10 遍，于70%乙醇中浸泡24 h，紫外灯照过夜，无菌超净台内吹干。 取对数生长细胞，105/mL 密度接种于放有盖玻片的6 孔板中培养，待细胞生长至50%以上融合，设不加药为对照组、奥曲肽20 ng/mL 组、多西他赛40 μg/mL 组、联合用药奥曲肽20 ng/mL+多西他赛40 μg/mL 组，分别处理细胞48 h，以甲醇∶冰醋酸(3∶1)4℃固定5min，PBS 漂洗， 用终质量浓度为5 mg/L Hoeehst33258荧光染料避光染色10 min，PBS 漂洗后滴抗荧光粹灭封片液封固;荧光显微镜下观察拍照。 实验重复3 次。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 MTT 法检测药物对胃癌细胞SGC-7901 细胞增殖的抑制作用

以1、5、20 ng/mL OCT 分别作用胃癌细胞SGC-7901 48 h后，MTT 结果显示，OCT 对SGC-7901 增殖有抑制作用， 抑制作用随着药物浓度而增强，呈剂量依赖方式，不同浓度之间抑制率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 流式细胞仪分析联合用药对细胞周期及凋亡的影响

OCT 作用SGC-7901 细胞24 h 后， 经流式细胞仪检测可出现轻度S 期阻滞，并出现典型的凋亡峰（sub-G1），提示OCT 可通过凋亡途径抑制胃癌细胞SGC-7901 生长。 DOC 作用于SGC-7901 细胞24 h 后， 经流式细胞仪检测可出现明显G2 /M 期阻滞，凋亡峰明显高于对照组（P＜0.05），提示DOC 亦可通过凋亡途径抑制胃癌细胞SGC-7901 生长。

2.3 荧光显微镜观察细胞形态

Hoechst33258 荧光染色后， 荧光显微镜下可见对照组的SGC-7901 细胞核比较完整均一，着色较淡，形态较规则，呈均匀的蓝色荧光，经奥曲肽作用细胞48h 后，细胞核偶有凋亡形态变化，经多西他赛作用48 h 后，荧光显微镜下观察到细胞大小不等，有典型的凋亡形态改变，细胞体积缩小、细胞质浓缩、细胞核染色质聚集，并有核碎裂及凋亡小体。 联合用药组可见大部分细胞质染色不均匀，染色质凝聚，细胞核裂解，可见凋亡小体。

3 讨论

胃癌在我国为最常见的消化道恶性肿瘤，治疗上采用以手术治疗为主，辅以放化疗等辅助治疗。 化疗可有效抑制和杀灭胃癌细胞，以减少复发和转移，提高患者生存期，改善生存质量。 以单一药物化疗效果较差，有效率仅为20%～30%，而联合不同作用的多种药物则可将有效率提高到30%～50%。 因联合用药不但可以杀死更多癌细胞，使患者进入缓解期，而且可以有效减少肿瘤产生对某种药物的耐药性， 所以较单一用药更受临床医师青睐。

该实验显示：奥曲肽与多西他赛联合组肿瘤细胞抑制率与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），在正常血药浓度下奥曲肽与多西他赛联合可提高肿瘤抑制率， 奥曲肽对多西他赛有增敏作用，与奥曲肽浓度无关，提高多西他赛对肿瘤细胞的抑制作用，提示可减少多西他赛临床用药量。 流式细胞仪分析细胞周期显示奥曲肽对肿瘤细胞细胞周期有轻微阻滞作用，并可诱发肿瘤凋亡。 多西他赛对胃癌细胞生长抑制作用明显，可阻滞细胞周期与G2/M 期，诱发凋亡作用更明显，与奥曲肽联合应用后，导致细胞凋亡比率更高，显示出更优越的抗肿瘤效果。 故奥曲肽与多西他赛联合应用于胃癌治疗可减少多西他赛临床应用剂量，从而减少多西他赛不良反应。 奥曲肽在体内的半衰期较短，代谢速度很快，该实验证实常规用药剂量下，在血药浓度变化范围内奥曲肽对多西他赛均有增效作用，提高了抗肿瘤治疗的临床应用效果。 另一方面，因奥曲肽对胃肠血流有减少作用，如先于多西他赛给药，将降低多西他赛在胃肠组织内的浓度，对抗肿瘤治疗产生不利影响，但当多西他赛进入细胞内后，即进入效应室后，其浓度衰减较慢，此时如给予奥曲肽，将减少胃肠血流量，减少多西他赛于胃肠组织中的清除，理论上亦可提高多西他赛抗肿瘤效果。

[1] 朱志图,王锴,郁云龙,等.蟾蜍灵联合奥沙利铂对胃癌MGC803 细胞增殖抑制及凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2011，31(17):3303-3306.

[2] 郭卫东,于健春,刘玉琴.二十碳五烯酸与表阿霉素联合应用对人胃癌细胞株MGC-803 的作用[J].中国医学科学院学报,2007，29(3):353-358.

[3] 吕文才,耿小平,孟翔凌,等.奥曲肽对人胃癌细胞的凋亡诱导作用[J].中国普外基础与临床杂志，2004,11(3):238-241.

[4] 石斌,李玉民,周彦明,等.生长抑素的表达与胃癌生物学行为相关性研究[J].临床肿瘤学杂志，2002（4）:241-243.

[5] 郭琳,王晓菲,朱金武,等.多西他赛两种剂型在beagle 犬体内基本药代动力学的比较研究[J].毒理学杂志,2011，25(4):252-256.