精液分析标准化和精液质量评估——WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)出版

陈振文 谷龙杰

1.国家人口计生委科学技术研究所(北京，100081);2.华中科技大学附属同济医院生殖医学中心

精液分析是评估男子生育力的重要方法，也是男科疾病诊断以及疗效观察的试验依据。精液常规分析易受采集方式、射精频度、温度、实验室条件、检验人员的技术熟练程度及主观判断能力等诸多因素的影响，导致分析结果发生偏差，所以精液的采集与分析必须严格按照标准化程序进行，才能提供受检者临床状况的必要信息。近年来随着男科学和生殖医学的快速发展，不少原有的概念和诊疗建议需要修订，为此WHO组织成立了专门的委员会，通过收集临床数据，修订出版了新的《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)，以期提高精液分析质量。

1 精液标本的采集和运送

精液采集规范化是做好精液分析的前提条件，因此在精液采集前务必详细告知受检者有关精液采集和运送的方法及注意事项。

1.1 精液采集次数

不育夫妇初诊时，男方应至少检测2～3次精液标本以获取基线数据，两次精液采集的时间应间隔7d～3周。如果两次精液分析的结果有明显差异，应再采集标本进行第3次分析。

1.2 精液采集时间

最好在实验室附近的私密的房间内进行，采集前应禁欲至少2d，最多7d。如果需要多次采集标本，每次的禁欲天数应尽可能一致，以减少精液分析结果的波动。每一份精液分析报告都应写明:受检者姓名、禁欲天数、标本采集的日期和时间、标本采集是否完整以及标本从采集到分析的时间间隔等。

1.3 精液采集及保存运送

最好采用手淫法采集精液，将精液收集于对精子无毒性的清洁广口玻璃或塑料容器中。如果要做微生物学检查或用于辅助生殖治疗，受检者应提前排尿并洗净双手和阴茎，用无菌容器收集精液。特殊情况下可采用特制的对精子无毒性的避孕套进行精液采集，并于采集后1h内送到实验室。如果在家里或其他场所采集精液，在运送到实验室期间应保持温度恒定在20～37℃，并予以记录。精液采集一定要完整，不完整的精液不宜进行分析。

1.4 无菌处理

精液标本可能含有致病菌和病毒，应视为生物危险品。实验室技术人员要注意防护，使用一次性手套和器皿。用过的器皿要消毒处理。对用于精液培养、生物测定、宫腔内人工授精或体外受精的标本，在处理过程中必须严格使用无菌材料和无菌操作。

2 精液的肉眼观察

2.1 精液的液化

精液射出后会很快呈现半固体凝胶的外观，通常在数分钟内开始液化变得稀薄，液化大多在15min内完成，如超过60min未能完全液化应作记录。正常液化的精液中可能含有不液化的胶冻状颗粒，这一现象没有临床意义。对液化不良的精液标本，可用机械混匀或酶消化(菠萝蛋白酶10U/L)的方法进行处理，也可以采用在标本中加入等体积的培养液并用加样器反复吹打的方法。应注意的是，所有这些处理方法可能影响精浆的生化、精子活力和精子形态学的测定结果，必须予以记录。

2.2 精液黏稠度

精液液化后，将精液吸入一支广口径(直径1.5mm)的一次性塑料吸液管，使精液借助重力滴下，观察拉丝的长度，可以评估精液标本的黏稠度。正常精液会形成不连续的小滴;黏稠度异常时液滴会形成超过2cm的拉丝。另一个检查方法是将一根玻璃棒插入精液，提起玻璃棒，观察拉丝长度。拉丝长度超过2cm应记录为异常的黏稠度。过高的精液黏稠度可干扰精子活力、浓度、精子表面抗体和生化标志物的检测。

2.3 精液的外观

正常的精液质地均匀、呈灰白色，禁欲时间长时精液可略带黄色。如果精子浓度非常低或无精子，精液可能显得透明些。含有红细胞的精液可呈红褐色。如有黄疸或服用某些维生素，精液可呈黄色。

2.4 精液的体积

第5版手册强调精确测量精液体积的重要性。推荐采用称重的方法计算精液的体积:预先测定空容器的重量，采集精液后再次称重，减去原始重量得到的差值即为精液的重量，再除以精液比重就可计算精液的体积，精液的实际比重约为1.014g/ml，实际工作中可用1g/ml替代;此外也可以将精液收集在广口带刻度量筒中直接读取精液体积。不推荐采用将容器中的精液转移到量筒或注射器中测定精液体积的方法，以免低估精液体积。正常男子每次射精量≥1.5ml。在没有精液丢失的前提下，如果精液体积过少，应考虑先天性双侧输精管缺如、射精管梗阻、不完全逆行射精以及雄激素缺乏等可能性。

2.5 精液的pH值

精液pH值反映了不同附性腺分泌液pH值之间的平衡，应在射精后同一时间测量，最好是30min后，但不超过1h。将精液标本混匀后，在pH试纸上(测试范围6.0～10.0)均匀地涂上一滴精液，等浸渍区颜色均匀后(30s内)立即与标准条带颜色对比，读出pH值。

3 精液的显微镜检查

精液显微镜检查包括精子浓度、精子活力、精子存活率、精子凝集、非精子细胞成分的测定和精子的形态学分析。建议使用相差显微镜进行新鲜精液未染色制片的所有检查。

3.1 湿片的制备

精液取样的体积和盖玻片的尺寸应标准化，以使精液在20μm左右的厚度下进行分析。具体方法是:混匀精液后，立即将10μl的精液滴在干净载玻片上，盖上22mm×22mm的盖玻片。盖玻片的重量使标本散开，注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡。等制片内精液不再漂移立即进行评估。由于温度会影响精子的活力分级，因此实验室的温度必须标准化，检测宜在20～24℃室温下进行。制备好的标本应先在100倍镜下观察是否有黏液丝形成，精子的聚集或凝集，除精子外的其他细胞以及标本在载玻片上展开的是否均匀，然后在200或400倍镜下评估精子活力，并确定检测精子浓度所需的精液稀释倍数。

3.2 精子凝集与聚集

精子聚集是指不活动精子之间，活动精子与黏液丝，活动精子与非精子细胞成分或细胞碎片等粘在一起，应如实记录。精子凝集是指活动精子以头对头、尾对尾或混合型相互粘在一起，提示可能存在抗精子抗体。应记录所有活动精子的凝集类型，凝集的程度分为1、2、3、4级:每个凝集少于10个精子，有很多自由活动精子为1级;每个凝集有10～50个精子，存在自由活动精子为2级;每个凝集多于50个精子，仍有一些自由活动精子为3级;所有精子凝集，数个凝集粘连在一起为4级。根据粘连部位分为A、B、C、D、E级:A级为头对头;B级为尾对尾;C级为尾尖对尾尖;D级为混合型，可以清晰看到头对头和尾对尾的凝集;E级为头和尾的缠结、无法清晰看到头部的凝集。

3.3 非精子细胞成分

精液中含有非精子细胞成分，包括泌尿生殖道的上皮细胞、生精细胞和白细胞等，后两者统称为“圆细胞”。一般而言，一份正常精液中所含圆细胞浓度应＜5×106/ml。白细胞，主要是中性粒细胞，存在于大多数人的精液中。过多的白细胞(白细胞精子症)可能与感染和精液质量差有关，应进行微生物学检验以证实有无副性腺感染，但如果未发现白细胞也不能完全排除副性腺感染的可能性。白细胞和生精细胞可用过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗体法鉴别。不同类型的未成熟生精细胞在精液中出现常提示精子发生异常。过氧化物酶阳性的白细胞浓度不应超过1×106/ml。非精子细胞也可采用血细胞计数板进行计数，方法同精子计数。另外，也可以用与精子的相对浓度来表示其它类型生精细胞和白细胞的浓度。计算方法为C=S×(N/400)，C:需计算的特定类型细胞浓度(106/ml)，N:计数400个精子时同视野中的特定类型细胞数，S:样本的精子浓度(106/ml)。

3.4 精子活力

精子的前向运动情况与受孕有密切的关联。在第5版手册中，将精子活动力分为前向运动(PR)、非前向运动(NP)、不活动(IM)，而不再沿用以往的将精子活动力分为a、b、c、d级的分类方法，这是新版手册中的一个重要修订。

可采用带有网格的目镜，以更好地评估精子活动力，评估过程中所检测的区域应距离盖玻片边缘至少5mm以上。应在室温或带有加热37℃载物台的显微镜下进行精子活动力评估，由于精子活动力与环境温度密切相关，最好将台面温度保持恒定在37℃。

要准确地评估精子活动力，应将精液充分混匀后，重复取样2次分别检测，先仔细观察网格区计数前向运动精子，接下来是在相同的网格内的非前向运动精子，最后是不活动精子。每个样本至少系统地观察5个视野，分析的精子应＞200个。两次分析结果之间的差异应在95%可信区间内，如果两个样本之间的差异过大，则应重新混匀标本后重复取样检查。第5版手册将 PR≥32%、(PR+NP)≥40%作为精子活动力的参考值下限，低于此下限时受孕的机会减低。

3.5 精子存活率

精子存活率指存活精子在所检测精子总数中的百分比。当活动精子百分数低于40%时，应检测精子存活率。不动的精子并不都是死亡精子，如果存活但不动的精子占很大比例则提示精子鞭毛可能存在结构缺陷。推荐采用伊红－苯胺黑染色排除法，单用伊红染色试验或低渗膨胀试验进行检测。伊红－苯胺黑染色以及单用伊红染色试验的原理是，存活精子的细胞膜可阻止精子被染料伊红所染色，而死亡精子则因细胞膜通透性改变而易被伊红染为红色，用光学显微镜或相差显微镜检测可以区分活精子(未着色)和死精子(着色)，而加用苯胺黑有利于更好地观察。而低渗肿胀试验的基本原理则利用存活精子的细胞膜能够形成渗透梯度的特性，当被置于低渗透压液体中时存活精子可因细胞外水分进入细胞内而造成细胞的肿胀，死亡精子则缺乏这种现象，从而可以判断精子是否存活，可用于辅助生殖技术。

3.6 精子浓度的初检

第5版手册中不再使用原来的“精子密度”这一名词，而是改为“精子浓度”，以更准确地表示一定体积精液中的精子数量这一概念。在精确计数精子浓度前要进行精子浓度的初检，以估计精确计数所需要的精液稀释倍数。对于厚度为20μm的精液标本来说，200倍高倍镜下每个视野下的容积约为16nl，400倍高倍镜下每个视野下的容积约为4nl。因此，计数每个视野的精子个数，就可粗略估算精子浓度。再据此决定精液所需的稀释倍数:每400倍视野≤15个精子或200倍视野≤60个精子，采用1∶2稀释;400倍视野16～100个精子或200倍视野64～400个精子，采用1∶5稀释;400倍视野超过101个精子或200倍视野超过404个精子，采用1∶20稀释。如果每个视野中的精子数目差异较大，提示标本不均匀，应重新混匀标本再取样检测。

当精子数目过少时，应根据检测目的和要求的不同决定下一步的处理方式。如果不需要得到精确的精子浓度，那么当每个400倍视野中精子数目＜4个或者每个200倍视野中＜16个时，可以报告为“精子浓度＜2×106/ml”，同时应报告是否发现前向运动精子;如果需要获得精确的精子浓度，可减少精液稀释的倍数、增加检测精液的总体积。

当任一湿片中都没有观察到精子时，应离心精液以确定在更大标本量中能否发现精子。取1ml精液用3 000g离心15min，弃去大部分上清液，将全部沉淀悬浮于约50μl精浆中，再分别取两份10μl沉淀物仔细检查，如果仍无法找到精子，才能做出“无精子症”的判断。如果在任一样本中观察到精子，则提示隐匿精子症。

3.7 精子浓度和精子总数

第5版手册特别强调每次射精中精子总数的重要性，认为精子总数能更准确地反映睾丸生精功能和输精管道的通畅程度。精子总数是精子浓度与精液体积的乘积，因此准确测定精子浓度十分重要。推荐采用改良Neubauer血细胞计数板测定精子浓度，检测前必须充分混匀精液标本，分别两次取样、两次稀释、两次检测。首先按事先估计的稀释倍数将精液稀释。标准稀释液的配制方法是:将50g NaHCO3和10ml 35%(v/v)甲醛溶液加入1 000ml纯水中，如果需要可添加0.25g台酚蓝或5ml饱和甲紫溶液(＞4mg/ml)加深背景显示出精子头部，4℃保存备用。

向计数板吹气使其轻微湿润，再将盖玻片紧压向计数池的支柱，确保盖玻片紧贴计数池。用移液器吸取10μl刚刚稀释好的精液，将移液器吸头小心地接触一个计数池V形槽的下缘，利用毛细作用使精液标本充满计数池。计数池不应过满或不满，也不应移动盖玻片。同样将10μl标本加入到另一个计数池中。将血计数板水平放在湿盒内至少4min后开始计数。计数应使用200或400倍的相差显微镜，每份样本检测200个以上的精子以减低误差。应计数有完整结构的精子(有头和尾)，有缺陷的精子(大头针状头或和无尾的精子头)应分开计数并记录。

血细胞计数板每个计数池共有9个网格，其中中央网格有5排，每排5个大方格。计数时，先评估一个计数池的中央网格，逐排计数，直到至少数到200个精子，并数完完整的一排。如果中央网格的5排中计数未满200个精子，那么还需计数与中央网格相邻的网格，直到数完至少200个精子。对于位于相邻两格分界线上的精子，只计数位于方格上界和左界的精子，而不计数位于下界和右界的精子。然后计数另一个计数池中相同体积的标本，计算两个计数池计数结果的总数和差异。两次计数之间的差异应在95%可信区间内，如变异过大应重新混匀标本再重复取样计数。计算两次计数的平均数作为最终的检查结果。根据精液稀释倍数计算原始精液中的精子浓度。

临床上也可用Makler或Microcell计数池来测定精子浓度，这些计数池使用方便、不必稀释样本，但应与血细胞计数板的检测结果进行比较和校正以保证其结果的可靠性。

3.8 精子形态学评估

人类精子形态的多样性造成精子形态评估非常困难，观察女性生殖道(尤其是性交后宫颈黏液中)的精子或从透明带表面回收的精子有助于定义具备潜在受精能力精子的外观。精子形态分析的关键是评估正常形态的精子，计算其百分比，因为只有正常形态的精子才有临床意义。对各类畸形精子也应进行详细分析，有特殊情况还应作记录。

3.8.1 涂片的制备 载玻片用不掉屑的纸巾用力擦干净备用，充分混匀标本后，根据精子浓度取5～10μl精液滴于载玻片一端，立即用另一张载玻片沿第一张载玻片表面在精液滴前方拖拉精液滴。精子浓度低时可离心浓缩标本，以获得尽可能高的浓度(但不应超过50×106/ml)然后按照正常标本的方法涂片。过于黏稠的标本、碎片过多的标本以及用于计算机辅助评估精子形态学的标本，可取0.2～0.5ml精液加入10ml生理盐水中稀释，离心弃去大部分上清液，将沉淀悬浮于20～40μl液体中，再取5～10μl精子混悬液涂片。涂片行空气干燥并固定，固定程序取决于染色方法。

3.8.2 染色方法 涂片空气干燥后应立即固定染色，推荐采用巴氏染色法、Shorr染色法或Diff－Quik染色法。在光学显微镜下观察，精子头部顶体区呈淡蓝色，顶体后区染成深蓝色，中段可染为略呈红色，尾部染成蓝色或淡红色，胞浆小滴常位于头部下部或围绕中段，染成粉红色、红色或橘色。快速染色方法由于涂片技术会导致精子分布不均匀，无法观察到形态学分类所需的细节，不建议使用。

3.8.3 正常精子形态学 精子包括头、颈、中段、主段和末段。光学显微镜下难以观察精子末段，因此可以认为精子由头(头和颈)和尾(中段和主段)组成。只有头和尾都正常的精子才认为是正常的，所有处于临界状态的精子均应认为异常。精子头外形应为光滑、轮廓规则的椭圆形，顶体区清晰，占头部的40% ～70%，顶体区没有大空泡，小空泡不超过2个，空泡大小不超过头部的20%，顶体后区不含任何空泡。中段细长、规则，长度与头部大约相等，主轴与头部长轴在同一直线上，残留胞浆不超过头部大小的1/3。主段均一，比中段细，长约45μm，相当于头部长度的10倍左右，没有锐利的折角。

3.8.4 异常精子形态学分类 畸形精子百分率升高常与精子异常发生或附睾病变有关，畸形精子一般受精潜力较低。主要的精子缺陷类型有:①头部缺陷:大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头、有空泡的头(未着色的空泡区域占头部20%以上或超过2个空泡)、顶体后区存在空泡、顶体过大(＞头部70%)或过小(＜头部40%)、双头以及上述缺陷的任何组合。②颈部和中段的缺陷:中段非对称地接在头部、过粗或不规则、锐角弯曲、异常细的中段和上述缺陷的任何组合。③主段缺陷:短尾、多尾、断尾、发卡形平滑弯曲、锐角弯曲、宽度不规则、卷曲或上述缺陷的任何组合。④过量残留胞浆:胞浆的大小超过精子头部的1/3。第5版手册提供了一系列精子正常和异常形态的精美图片，可供实验人员参考。

3.8.5 精子形态学涂片的评估 染色后使用1 000倍油镜在亮视野下观察，应系统地选择涂片上多个区域进行评估，应评估每个视野中的所有精子，每张涂片至少评估200个精子以减低误差。两个重复取样的检查结果之间的差异应在95%可信区间内，计算其平均数作为标本的正常形态百分率。检测时仅评估具有头部和尾部的完整精子，不计数未成熟的生殖细胞。重叠的精子和头部枕在其他颗粒边缘的精子也不应评估。正常形态精子的参考值下限为4%。

对所有异常形态精子进行分类，可能有助于临床和研究工作。可注明精子缺陷的类型并计算不同缺陷精子的百分比。游离的精子头部或尾部不作为精子计数，也不作为异常精子进行计数。如果所有精子都呈现一种特定的结构缺陷，比如小圆头精子、无尾精子头或大头针状精子，应予以正确的报告。

4 常规精液分析参考值(WHO手册，第5版)

精液量≥1.5ml;pH值≥7.2;精子浓度≥15×106/ml;精子总数≥39×106/1次射精;精子前向运动百分率≥32%;正常形态率≥4%;精子存活率≥58%;白细胞 ＜1 ×106/ml。