肺炎链球菌的扩增片段长度多态性快速检测方法的建立和应用

杨锦红 刘 洋 王新林 李方去 陶洪群 李向阳

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，S.p)在世界范围内仍然是一种重要的病原体，可引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎及菌血症等多种严重疾病［1，2］。对肺炎链球菌的诊断，目前主要依赖传统方法——培养法进行检测，但是培养法需要对微生物分离、培养和鉴定等检测存在着耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点，对临床快速诊断，尤其是侵袭性感染的诊断不及时，造成临床治疗上的延误。随着分子生物学技术的发展，肺炎链球菌的快速诊断研究进展迅速，其中有环介导等温核酸扩增技术(LAMP)、PCR检测核糖体(16SrRNA)、BOX－PCR、荧光定量PCR、免疫层析法、DNA探针杂交等，从基因/基因组的层面对肺炎链球菌进行快速诊断［3，4］。

材料与方法

1.菌株来源:2010年3～6月在温州医学院附属第二医院住院患儿送检的呼吸道、血液及脑脊液标本分离的非重复的20株肺炎链球菌。质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619。

2.仪器:Microscan Walkaway－90SI型全自动细菌鉴定仪(德国西门子公司)、PCR仪(德国Eppendorf公司产品)、电泳仪(美国BIO.RAD公司)、凝胶成像系统(北京六一公司)

3.试剂:PCR试剂和DNA MarkerⅠ购于TaKaRa大连宝生物公司，引物参照文献设计［5］，由上海生工生物技术有限公司合成。限制性内切酶EcoRⅠ、MseⅠ购自Fermentas公司，DNA分子质量对照购自MBI公司。EcoRⅠ接头、MseⅠ接头、引物序列见表1。

4.菌种鉴定及药敏试验:挑选血平板上脐窝状的可疑菌落分纯，同时做奥普托欣(Optochin)试验，再用 Microscan Walkaway－90SI型全自动细菌鉴定仪鉴定及药敏试验，判断标准参照CLSI(2010版)标准。

5.AFLP实验:根据张顺等［6］报道的方法改进后用于实验。(1)基因组DNA的制备:细菌DNA的制备:挑3～5个菌落调制成0.5麦氏点菌液，采取一系列稀释梯度，配制成浓度依次为1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml的菌液，收集细菌采用CTAB法提取肺炎链球菌染色体DNA即为扩增检测的模板液，用1%琼脂糖电泳检测基因组DNA，并用紫外分光光度计定量。(2)基因组DNA的双酶切:取基因组DNA各2μl，内切酶EcoRⅠ5U、MseⅠ5U，10×Buffer 4μl，补水至40μl，先在37℃水浴5h，然后转入65℃水浴2h，用1%琼脂糖电泳检测酶切产物。(3)接头的连接反应:取酶切产物20μl，EcoR I Adapter、Mse I Adapter各1μl，T 4 DNA连接酶0.5μl，10× Buffer 3μl，补水至30μl，22℃，连接过夜。(4)PCR扩增:PCR扩增反应体系体积为25μl，上下游引物(20μmol/L)各0.5μl，dNTP(100mmol/L)2μl，模板 DNA 3μl，MgCl2(25mmol/L) 1.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，EX Taq酶(5U/μl)0.125μl，ddH2O 14.375μl，混匀后进行扩增反应。循环参数为:94℃预变性4min，然后94℃15s→65℃30s→72℃15s共40个循环，最后72℃延伸10min。(5)电泳分析:将产物放在6%的琼脂凝胶中，150V电泳20min后用凝胶成像仪观察DNA条带的分布，产物片段多在100～600bp之间呈现出梯状分布，特征性条带明显，具有较强的辨识度。

结果

1.特异度试验:检测20株肺炎链球菌，结果均阳性(图1)。15株非肺炎链球菌均阴性，金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌、宋内志贺菌、伤寒沙门菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌及铜绿假单胞菌等多种细菌均为阴性，见图2。表明AFLP－PCR具有良好的特异性。

图1 20株肺炎链球菌AFLP图谱1～19.肺炎链球菌临床分离株;20.肺炎链球菌ATCC49619，M.Marker

图2 特异性试验AFLP结果

2.灵敏度试验:经活菌平板计数，检测细菌原液浓度为1.5×108CFU/ml，分别进行稀释成为1.5× 108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5× 103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml，AFLP－PCR方法可检测到第6个稀释度，最低检测浓度为1.5× 103CFU/ml，见图3。

图3 敏感性AFLP－PCR结果

讨论

传统细菌培养分离生化鉴定方法作为细菌诊断的金标准，检测肺炎链球菌，从微生物分离培养和形态学鉴定到生化分析，做出确诊整个过程约需2～3天;而对于肺炎链球菌所致感染，尤其是侵袭性的深部感染，要求快速、方便的特点，该法不能满足要求。近年来，以PCR技术为代表的病原核酸检测技术得到不断发展。其中，PCR、荧光定量PCR作为快速检测技术得到了一定的应用。然而这些方法虽然可用于快速检测，但因灵敏度和特异度上的差别，加上检测费用较高，在现场使用有一定的局限性。扩增片段长度多态性快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的AFLP－PCR具有高效、快速、简便的优越性，为及时快速检测提供了新方法。

本研究中选择了肺炎链球菌的特异基因作为靶序列，设计了两对引物，对基因组DNA进行双酶切后链接，优化反应条件，选择适宜的反应液配方，建立了AFLP方法检测肺炎链球菌。该方法灵敏度高，最低可检测到1.5×103CFU/ml，与其他PCR快速诊断检测水平相当［7，8］;特异度高，未出现假阴性和假阳性，本研究所用20株肺炎链球菌均能检测出来，而15株非肺炎链球菌，包括金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌等革兰阳性菌，也包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰阴性菌，均未检测出来，表明特异度高，并且电泳图形具有一定的可识别性。

为了及时准确地检测出疑似病例是否为肺炎链球菌感染，需要有灵敏特异的检测方法。提取细菌DNA进行肺炎链球菌病原学的鉴定，尤其是与菌落形态与其相似的草绿色链球菌鉴别，是人们一直在寻找的方法。AFLP简单、快速、敏感性好、特异性高，本研究AFLP条带较多，特征性强，分辨率较高，能可靠地检测出肺炎链球菌的同时，还可以分析出亲缘关系，适合肺炎链球菌的早期诊断，尤其是无菌体液中的侵袭性感染，有着较大的诊断意义。

1 綦廷娜，王和，陈峥宏.肺炎链球菌L型对人淋巴细胞因子分泌刺激作用［J］.中国公共卫生，2010，26(5):610－611

2 Barzilay EJ，Brien KL，Kwok YS，et al.Could a single dose of pneumococcal conjugate vaccine in children be effective?Modeling the optimal age of vaccination［J］.Vaccine，2006，24(7):904－913

3 胡晓彦，桂炳东，王伶，等.BOX－PCR技术在肺炎链球菌的检测中的应用［J］.实验与检验医学，2010，28(3):209－211

4 樊慧珍，于化鹏，黄文杰，等.DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌［J］.第一军医大学学报，2005，12(10):1503－1505

5 Kalpoe JS，Templeton KE，Horrevorts AM，et al.Molecular typing of a suspected cluster of nocardia farcinica Infectionsby use of randomly amplified polymorphic DNA，pulsed－field gel electrophoresis，and amplified fragment length polymorphism analyses［J］.Journal of clinicalmicrobiology，2007，45(12):4048－4050

6 张顺，蔡挺，陈琳，等.用AFLP分型和分子标记研究鲍曼不动杆菌院内感染传播途径［J］.现代实用医学，2009，21(1):7－9

7 Dijkshoorn L.Typing acinetobacter strains:applications and methods［J］.Acinetobacter Biology and Pathogenesis，2009，1(20):85－88

8 胡农，蔡挺，张顺，等.耐药鲍曼不动杆菌扩增片段长度多态性分析指纹图谱数据库的建立［J］.浙江大学学报:医学版，2007，36 (6):537－542