用RP－HPLC法测定靶控输注下血浆中的丙泊酚浓度

夏 雨，魏 威，李 任，史丽敏，刘韶华，田 鸣

（1.首都医科大学附属北京友谊医院西药剂科，北京100050；2.首都医科大学附属北京友谊医院麻醉科，北京100050）

丙泊酚作为全身静脉麻醉药在临床广泛用于麻醉诱导及维持。靶控输注（target－controlled infusion，TCI）是指在输注静脉麻醉药时，以药动学和药效学原理为基础，通过调节血浆药物浓度来控制或维持适当的麻醉浓度，以满足临床麻醉的一种静脉给药方法［1］。近年来，TCI在国内外已逐步代替间断注射或持续输注，成为最具应用前景的丙泊酚静脉麻醉方式［2，3］。虽然TCI给药时可显示计算血浆浓度（calculated plasma concentration，Ccp）和效应室浓度（effect－site concentration，Ce）等信息，作为麻醉深度的判断指标，但是由于目前选用的参数模型多为国外大规模群体药动学模型，与中国人的药动学不匹配［4，5］，从而导致Ccp与实测血药浓度（measured plasma concentration，Cmp）之间存在差异［6］。丙泊酚的药动学特点是靶控输注给药方式的主要理论基础，而建立一种条件适合、准确、简便、稳定的丙泊酚血药浓度测定方法则是群体药动学研究的基础。目前，测定丙泊酚的血浆浓度多采用气相色谱、HPLC法和气－质联用等方法，方法复杂且未结合临床研究条件。本研究建立了操作更为快速、简便的RP－HPLC法检测丙泊酚的血药浓度，并以临床小样本数据对方法进行验证，以期为丙泊酚在中国人的群体药动学研究奠定基础。

1 材 料

1.1 仪器 Agilent 1100型HPLC仪（包括真空脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、惠普1100色谱工作站及自动进样装置（美国Agilent公司）；Shim－pack CLC ODS－C18色谱柱（150mm× 6.0mm，5μm，日本岛津公司）；MS2型涡旋混合器（德国IKA公司）；2－5型离心机（德国Sigma公司）。

1.2 药品和试剂 丙泊酚对照品（纯度100.0%，1g／ml，英国AstraZeneca公司惠赠，批号L－22270－906－049）；内标：百里酚（thymol，分析纯，中国食品药品检定研究院，批号100508－200301）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；水为纯净水（首都医科大学附属北京友谊医院药检室自制）；空白血浆（首都医科大学附属北京友谊医院血液科提供）。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制 （1）内标工作液：精密称取百里酚25mg溶于50ml甲醇，配成浓度为0.5mg／ml的储备液，保存于4℃冰箱备用。工作时，将该储备液用适量甲醇溶解，稀释成浓度为10μg／ml的内标工作液。（2）血浆样品溶液：精密吸取200μl自然解冻后的人血浆，置于5ml带盖的试管中，加入甲醇20μl，混匀，精密加入10μg／ml的内标工作液600μl，再次混匀后，以603.7×g离心10min，取上清液即为血浆样品溶液。（3）对照品溶液：精密吸取1ml丙泊酚对照品溶液，用甲醇稀释到100ml，再取0.5ml稀释到50ml，得到浓度为100.0μg／ml的对照品储备液。精密量取该储备液适量，用甲醇稀释，配成系列浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg／ml的丙泊酚对照品溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：Shim－pack CLC ODS－C18柱（150mm×6.0mm，5μm）；流动相：乙腈∶水＝65∶35，流速：1.5ml／min；检测波长：220nm；柱温：25℃：进样量：100μl。在此色谱条件下，取空白血浆、含内标工作液的空白血浆、含内标工作液和丙泊酚对照品的空白血浆以及血浆样品分别进样测定，得到色谱图见图1。由图1可见，血浆中内源性物质和临床可能的合并用药不干扰主药的测定，内标与丙泊酚完全分离且峰形良好，丙泊酚和内标百里酚的保留时间分别约为7.5和4.7min。

图1 丙泊酚的HPLC谱图Figure 1 HPLC photograms of propofol

2.3 标准曲线的制备 精密量取空白血浆180μl放入5ml带盖试管中，加入不同浓度的丙泊酚对照品溶液20μl，得到丙泊酚系列浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg／ml的血浆样品，混匀，精密加入内标工作液600μl，再次混匀，以603.7×g离心10min，，取上清液作HPLC分析。将丙泊酚与内标的峰面积之比（Y）对浓度（X）进行线性回归，得到标准曲线方程：Y＝11.329 X－0.051 5（r＝0.999 8），线性范围为0.05～5.0μg／ml，最低检测浓度为0.05μg／ml（S／N≥3）。

2.4 回收率和精密度实验 取空白血浆加入适量丙泊酚对照品储备液，配制成低、中、高浓度分别为0.5、2.0、5.0μg／ml的血浆样品，按2.1项下方法（2）处理，得到血浆样品溶液。在同1d内进样5次，计算丙泊酚的回收率和日内精密度；在第1、3、5天各测定1次，计算日间精密度，结果见表1。

2.5 稳定性实验 取2.4项下丙泊酚低、中、高浓度分别为0.5、2.0、5.0μg／ml的血浆样品，在配置后4℃条件下保存1、15、30d，测定浓度并计算RSD。结果低、中、高浓度丙泊芬的RSD分别为3.84%、7.74%和2.73%（n＝5）。由此可见，丙泊酚血浆样品在配置后储存30d无明显变化，稳定性良好。

2.6 靶控输注下测定丙泊酚的血浆浓度

表1 丙泊酚的回收率和精密度实验结果Table 1 Results of recovery and precision tests of propofol（n＝5，±s，%）

表1 丙泊酚的回收率和精密度实验结果Table 1 Results of recovery and precision tests of propofol（n＝5，±s，%）

（ρB／μg·ml－1） 日内RSD浓度 日间RSD 回收率0.5 2.38 5.93 103.0±2.5 2.0 1.42 5.12 98.0±1.4 5.0 3.07 4.54 102.5±3.1

2.6.1 临床资料和麻醉方案 选择5例行全身麻醉的病人，男性3例，女性2例，年龄32～71岁，均符合美国麻醉医师协会病情估计分级I～III级，无全身麻醉禁忌，手术时间2～4h，无明确的精神疾病、药物滥用及酗酒史，术中无大出血。所有病人均通过肘正中静脉在30min内输入乳酸钠林格液，剂量为10ml／kg，之后采用“Diprifusor”TCI系统（由英国AstraZeneca公司“得普利麻”预充注射器、Diprifusor识别软件、靶控输注软件，以及英国Grasby公司3500注射泵组成），选择内置的TCI模式，输入病人的年龄和体重，以靶控血浆浓度（target－controlled plasma concentration，Ctp）3.5μg／ml输注丙泊酚，同时以Ctp 4.0ng／ml输注瑞芬太尼，给予罗库溴铵，剂量为0.9mg／kg，2min后行气管内插管，待丙泊酚Ccp达到3.5μg／ml并持续30min后，将Ctp下调为3.0μg／ml，间断给予罗库溴铵维持肌松。待丙泊酚Ccp达到3.0μg／ml并持续30min后，再将Ctp下调为2.5μg／ml。手术结束前停用丙泊酚和瑞芬太尼，静脉给予芬太尼0.1mg。

2.6.2 血样采集 在丙泊酚Ccp分别达到3.5、3.0、2.5μg／ml并持续30min时，抽取桡动脉血各3ml，注入含肝素的试管内，以603.7×g离心10min，分离血浆，保存于4℃冰箱备用。测定时，将血浆按2.1项下方法（2）操作，制备血浆样品溶液，测定丙泊酚的浓度，结果5例病人在上述3个时间点的血药浓度平均值分别为（3.48±0.19）、（2.99±0.12）和（2.48±0.17）μg／ml，与靶控输注泵上显示的Ccp比较，相对标准偏差分别为5.49%、3.96%和6.97%。

3 讨 论

丙泊酚的化学结构中具有苯酚母核，有较强的紫外吸收和荧光吸收。本研究的HPLC法采用紫外检测器，虽然灵敏度较荧光检测器低，但最低检测限低至0.05μg／ml。对于临床麻醉监测，TCI麻醉诱导期丙泊酚的血浆浓度在3min左右就达到3.5μg／ml，麻醉诱导及苏醒期血药浓度大多维持在1～5μg／ml，因此紫外检测法可以满足测定要求。

本研究采用沉淀法进行血浆样品处理，比萃取法更简单、快速，适用于临床大样本血药浓度监测。在沉淀剂的选择上，经过对比实验，发现用乙腈时在内标峰处有杂质峰干扰，而用3倍体积的甲醇沉淀血浆蛋白质完全，无需添加三氯乙酸或硫酸铵等蛋白质沉淀剂，亦无干扰峰出现，因此采用在血样中直接加入内标物的甲醇溶液来沉淀蛋白质，再次简化了预处理过程。本研究仅用乙腈和水组成流动相，即可得到良好的色谱峰峰形和合适的出峰时间，流动相体系简单，易于重复。本研究考察了血浆中的其他药物成分，即5例病人手术前与手术中与丙泊酚合并使用的药物，如苯巴比妥、多巴胺、瑞芬太尼、罗库溴铵、利多卡因、肾上腺素、甘露醇、地塞米松、肝素钠和鱼精蛋白等对主药峰的影响，结果发现其他药物并不干扰内标和丙泊酚的测定，不会造成主药不出峰或出峰时间延迟，表明该法专属性较好，可以用于靶控输注下丙泊酚血浆浓度的测定。

采用靶控输注丙泊酚，在其Ccp达到Ctp时再继续平衡30min，此时丙泊酚的血浆浓度已达到相对稳态，个体间药动学差异被降至最小，采集血样并测定Cmp，与靶控输注泵上显示的Ccp进行比较，差距为3.96%～6.97%，表明本法可以准确测量丙泊酚的血浆药物浓度。本方法简便、快速、准确、重现性好，可以满足丙泊酚临床药动学研究的需要。

［1］ Glen J B.The development of‘Diprifusor’：a TCI system for propofol［J］.Anaesthesia，1998，53（Suppl 1）：13－21.

［2］ Raeder J.Opioid or propofol：what kind of drug for what kind of sedation？Manual dosing or target－controlled infusion？［J］.Anesth Analg，2009，108（3）：704－706.

［3］ Viviand X，Léone M.Induction and maintenance of intravenous anaesthesia using target－controlled infusion systems［J］.Best Pract Res Clin Anaesthesiol，2001，15（1）：19－33.

［4］ 叶红波，郑 宏，张兴安，等.多中心异丙酚群体药物动力学评价［J］.药学学报，2010，45（12）：1550－1558.

Ye HongBo，Zheng Hong，Zhang XingAn，et al.Population pharmacokinetic modeling and evaluation of propofol from multiple centers［J］.Acta Pharm Sin，2010，45（12）：1550－1558.In Chinese with English abstract.

［5］ 林彦俊，李 羽，刘 斌.国人群体异丙酚药代动力学参数靶控输注系统的功能评价［J］.四川大学学报（医学版），2006，37（5）：814－815.

Lin YanJun，Li Yu，Liu Bin.Function evaluation of targetcontrolled infusion system in population pharmacokinetics of propofol in Chinese［J］.J Sichuan Univ（Med Sci），2006，37（5）：814－815.In Chinese with English abstract.

［6］ 张马忠，吴 健，王珊娟，等.靶控输注异丙酚的临床应用和准确性评价［J］.中华麻醉学杂志，2002，22（11）：660－663.

Zhang MaZhong，Wu Jian，Wang ShanJuan，et al.The accuracy of target－controlled infusion of propofol in Chinese［J］.Chin J Anesthesiol，2002，22（11）：660－663.In Chinese with English abstract.