不同类型淋巴瘤患者肿瘤坏死因子-β的表达及其临床意义*

陈海霞,邹红云,顾 霞△,盖玉萍,晁亚妮

(1.新疆医科大学第一附属医院病理科,乌鲁木齐 830054;2.兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所 830000)

不同类型淋巴瘤患者肿瘤坏死因子-β的表达及其临床意义*

陈海霞1,邹红云2,顾 霞1△,盖玉萍2,晁亚妮2

(1.新疆医科大学第一附属医院病理科,乌鲁木齐 830054;2.兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所 830000)

目的探讨不同类型淋巴瘤患者肿瘤坏死因子-β(TNF-β)在肿瘤组织与血浆中表达及其临床意义｡方法 收集97例不同类型淋巴瘤患者石蜡组织和血浆标本,应用免疫组化和ELISA法观察组织与血浆中TNF-β表达情况｡结果TNF-β在霍奇金淋巴瘤(HL)､弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)､浆细胞肿瘤(PCN)､小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病(SLL/CLL)､滤泡性淋巴瘤(FL)､周围T细胞淋巴瘤(PTL)表达较高,而在淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)､结外NK/T细胞淋巴瘤(NK/TCL)表达较低,各种类型淋巴瘤组织TNF-β的表达情况比较,差异无统计学意义(P0.05)｡在 HL､DLBCL､PCN､SLL/CLL､FL､PTL患者血浆中TNF-β水平高于健康对照组,差异有统计学意义(P0.05)｡组织中TNF-β表达在国际预后指标(IPI)评分的中､高危组与低危组比较,差异有统计学意义(P0.05)｡TNF-β在组织与血浆中的表达无相关性(rs=0.12,P0.05)｡结论TNF-β在淋巴瘤组织与血浆中都有不同程度表达,提示TNF-β在淋巴瘤发生､发展中起到一定作用,但是TNF-β与淋巴瘤的关系比较复杂,不同的类型可能存在不同的机制｡

淋巴瘤;肿瘤坏死因子类;组织;血浆

淋巴瘤是淋巴结或结外淋巴组织起源的恶性肿瘤,其组织学类型多样,形态复杂多变,具有高度的异质性｡尽管目前有部分类型淋巴瘤对化疗有效,但仍有一部分治疗效果差,预后不佳｡肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一种具有广泛生物学效应的细胞因子,淋巴细胞经抗原或有丝分裂原致敏而产生的具有肿瘤杀伤及免疫调节功能淋巴毒素α(lymphotoxin-α)命名为TNF-β｡近年来发现淋巴瘤患者血清中TNF-α､TNF-β水平升高,且高水平的TNF-α与淋巴瘤的不良预后有关[1]｡对于TNF-β是否有类似的作用,未见文献报道｡本实验检测TNF-β在新疆地区不同类型淋巴瘤患者中表达情况,探讨其在淋巴瘤发生､发展过程中的作用机制,为淋巴瘤的临床诊断､治疗和预后判断提供理论依据｡

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集新疆医科大学第一附属医院病理科2005年1月至2010年12月确诊为淋巴瘤的石蜡组织标本97例､淋巴结反应性增生石蜡组织标本5例｡所有淋巴瘤病例均做 免 疫 组 化 CD3､CD5､CD10､CD20､CD23､CD30､CD38､CD45RO､CD79α､BCL-2､BCL-6､MUM-1检测｡根据 WHO2008标准重新诊断进行分类再纳入收集范围内[2],其中霍奇金淋巴瘤(HL)12例,弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)30例,浆细胞肿瘤(PCN)20例,小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病(SLL/CLL)13例,淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)8例,滤泡性淋巴瘤(FL)3例,黏膜相关淋巴组织边缘区B细胞淋巴瘤(MATL)2例,套细胞性淋巴瘤(MCL)2例,周围T细胞淋巴瘤(PTL)4例,结外 NK/T细胞淋巴瘤(NK/TCL)3例｡

1.1.2 血液标本 收集新疆医科大学第一附属医院血液科2005年1月至2010年12月经上述石蜡组织标本确诊为淋巴瘤患者的血液标本97例,其中,男54例,女43例;汉族63例,少数民族34例(维吾尔族28例,哈萨克族6例);年龄13～83岁,平均(52.44±15.33)岁｡健康对照组血液标本85例,为健康体检者,其中男51例,女34例;汉族58例,少数民族27例(维吾尔族23例,哈萨克族4例);年龄15～50岁｡取空腹静脉血2mL,EDTA抗凝,离心分离血浆,-20℃保存备用｡

1.1.3 分类方法 按照Ann Arbor进行临床分期(Ⅰ､Ⅱ､Ⅲ､Ⅳ期);根据国际预后指标(international prognosis index,IPI)分为低危组(0～1分)､中危组(2～3分)､高危组(4～5分);根据是否有B症状分为A组(无B症状)､B组(有B症状);根据医院全自动生化分析仪所测得乳酸脱氢酶(LDH)300U/L为正常;C反应蛋白水平小于或等于10mg/L为正常;β2微球蛋白水平小于或等于3mg/L为正常;部分病例资料不全,在分析中去除｡

1.1.4 试剂 Super Vision两步法免疫组化试剂盒､TNF-β多克隆抗体购于武汉博士德生物工程公司;血浆TNF-β测定ELISA试剂盒购于上海蓝基生物科技有限公司｡

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 组织标本经10%中性甲醛溶液固定,常规脱水,石蜡包埋,4μm厚切片,切片常规脱蜡水化;3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,枸橼酸缓冲液(pH=6.0)进行抗原热修复,TNF-β一抗(工作液按1∶30稀释)在4℃冰箱过夜,DAB显色,苏木素复染｡以乳腺癌组织作为阳性对照,PBS代替一抗作为阴性对照｡

1.2.2 ELISA 应用人TNF-βELISA试剂盒,以双抗体夹心ELISA法检测血浆TNF-β的含量｡主要步骤:室温下(20～25℃)在空白微孔中加入50μL标准品溶液,再加入50μL样品,空白对照中加入50μL蒸馏水｡除空白对照孔外,在各孔中加入100μL酶标记溶液,37℃孵育1h,充分清洗酶标板4次;然后在各孔中加入显色剂A､B液各50μL,避光反应10 min,各孔中加入50μL终止液,混匀后用上海安泰model AT-858型自动酶标分析仪检测450nm处吸光度值绘制TNF-β标准曲线,从中求得TNF-β含量(单位pg/mL)｡

1.3 结果判定标准

1.3.1 免疫组化结果判定标准 TNF-β阳性产物主要定位于细胞质,部分细胞膜也有着色｡以肿瘤细胞质中出现淡黄至棕黄色颗粒为阳性细胞,根据肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比分计分:≤10%为0分,>10%～25%为1分,>25%～50%为2分,>50%～75%为3分,>75%为4分;根据阳性细胞的着色强度计分:无色为0分,淡黄为1分,黄色为2分,棕黄色为3分｡两积分相乘,0分为阴性(-),>0～4分为弱阳性(+),>4～8分为中等阳性(++),>8～12分为强阳性(+++)[3];弱阳性及以上为阳性表达｡

1.3.2 ELISA法检测结果判定标准 为了比较免疫组化与ELISA结果是否有相关性,将 TNF-β含量进行数值转换｡TNF-β含量值经SPSS软件分析,可测得P25=113.25pg/mL,中位数(M)=190.01pg/mL,P75=290.44pg/mL｡根据以上值将计量资料变换成半定量资料:TNF-β的含量小于113.25pg/mL为阴性(-),113.25～190.01pg/mL为弱阳性(+),190.02～290.44pg/mL为阳性(++),>290.44pg/mL为强阳性(+++)[3]｡

1.4 统计学处理

用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,计数资料采用χ2检验,等级资料采用Spearman相关性检验,检验水准α=0.05,以P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 不同类型淋巴瘤组织中TNF-β表达 在不同类型淋巴瘤组织中TNF-β阳性表达主要为肿瘤细胞｡HL组织中阳性细胞主要为R-S细胞,但多为弱阳性表达,见封2图1｡在非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者中,除MALT和MCL病例较少,且TNF-β为阴性表达外,其余各型均有不同程度的表达｡TNF-β在DLBCL､PCN､SLL/CLL､FL､PTL中表达较高,见封2图2､3;而在LBL和NK/TCL中表达较低｡在各种淋巴瘤组织中TNF-β表达阳性率比较,差异无统计学意义(P0.05),见表1｡TNF-β在HL和NHL组织中的血管内皮细胞及吞噬细胞也有不同程度表达｡在反应性增生淋巴结滤泡生发中心细胞(中心细胞和中心母细胞)､副皮质区的免疫母细胞､毛细血管内皮细胞TNF-β呈弱阳性表达,而套区､副皮质区小淋巴细胞TNF-β呈阴性表达,见封2图4｡

表1 不同类型淋巴瘤组织中TNF-β表达

2.2 不同类型淋巴瘤患者血浆中TNF-β水平 在HL､DLBCL､PCN､SLL/CLL､FL､PTL患者血浆中 TNF-β水平高于健康对照组,差异有统计学意义(P0.05);而在 MCL､NK/TCL血浆中TNF-β水平高于健康对照组,但差异无统计学意义(P0.05);LBL､MALT患者血浆中 TNF-β水平低于健康对照组,差异无统计学意义(P0.05);各种类型淋巴瘤患者血浆TNF-β比较差异无统计学意义(P0.05),见表2｡

表2 不同类型淋巴瘤患者与健康对照组血浆中TNF-β水平比较(±s,pg/mL)

表2 不同类型淋巴瘤患者与健康对照组血浆中TNF-β水平比较(±s,pg/mL)

组织类型n±s 85 179.23±44.79 HL患者 12 422.65±578.96 DLBCL患者 30 217.80±138.88 PCN患者 20 240.10±261.45 SLL/CLL患者 13 225.78±180.22 LBL患者 8 171.13±79.73 FL患者 3 881.27±844.94 MALT患者 2 178.59±24.52 MCL患者 2 197.00±230.34 NK/TCL患者 3 197.44±75.21 PTL患者健康对照组4 234.59±102.72

2.3 TNF-β在淋巴瘤患者组织和血浆中表达与临床病理特征之间关系 组织中TNF-β表达在IPI评分的中､高危组与低危组间比较,差异有统计学意义(P0.05),其余各组之间差异无统计学意义(P0.05);临床病理特征不同患者血浆中TNF-β水平比较,差异均无统计学意义(P0.05),见表3｡

表3 TNF-β在淋巴瘤组织和血浆中表达与临床病理特征之间关系

2.4 TNF-β在不同类型淋巴瘤患者组织与血浆中表达的相关性 经Spearman等级相关性检验,二者无相关性(rs=0.12,P0.05),见表4｡

表4 TNF-β在不同类型淋巴瘤患者组织与血浆中表达的相关性

3 讨 论

TNF属细胞因子家族,主要成员有 TNF-α和TNF-β｡TNF-β与TNF-α在基因､分子结构及生物学功能上都有许多相似之处｡TNF-β具有复杂的生物学活性,广泛参与炎症反应､免疫系统的发育和免疫调节等[4]｡国外对TNF-β基因多态性与NHL关系的研究有一些报道,但结果不尽相同[5-6]｡研究表明,TNF对肿瘤的作用呈双向性,既可杀伤肿瘤细胞,亦可促使肿瘤细胞生长和浸润｡TNF-β+252基因多态性在一定水平上决定着个体的TNF-β分泌水平[5-7]｡正常情况下,TNF-β是以肿瘤细胞自分泌或间质细胞旁分泌对局部起作用,理论上应是抗肿瘤作用,但是在病理状态下抑制了细胞内TNF-β基因的转录和(或)翻译,影响了TNF-β分泌,从而降低了机体局部抗肿瘤作用｡因此,有些学者认为体内TNF可能起到内源性肿瘤促进剂的作用[8]｡研究发现恶性淋巴瘤患者组织和血清中TNF表达水平增加,较高水平的TNF与淋巴瘤不良预后有关[9]｡

本研究发现,在HL患者组织和血浆中TNF-β表达明显升高,R-S细胞均有不同程度表达｡据参考文献[8,10]报道HL患者TNF-βmRNA表达增加,R-S细胞能产生多种细胞因子,并能表达细胞因子受体和活化抗原｡HL中TNF-β的高表达可能在其发生､发展中起着重要作用,检测TNF-β可能有助于HL的诊断｡DLBCL与PTL属于侵袭性淋巴瘤,肿瘤细胞具有高增殖活性､低凋亡率｡在DLBCL与PTL组织和血浆中TNF-β高表达与淋巴瘤不良预后有关,与参考文献[10-11]报道一致｡PCN属于惰性淋巴瘤,肿瘤细胞分泌的TNF具有促使骨质溶解加速病程进展的作用[12],Davies等[13]发现TNF基因多态性与浆细胞骨髓瘤发病有关;本组研究中3例FL有1例为Ⅲ级,2例为Ⅱ级,TNF-β表达水平高于其他类型｡Jaffy等[2]报道FL组织学分级与预后有关,也有报道称FL患者TNF-βmRNA水平高于其他类型淋巴瘤[14],与本研究结果一致｡因此,TNF-β在PCN与FL组织和血浆中高表达可能与其疾病进展及不良预后有关｡

本组研究发现TNF-β在SLL/CLL组织和血浆中表达较高,该组病例中有8例伴有白血病,病程多为Ⅲ～Ⅳ期,Nagy等[15]报道TNF-β表达在SLL伴有白血病患者高于没有白血病者,并且与其病程进展有关,与本研究结果一致｡本研究中2例MCL和2例MALT淋巴瘤组织中TNF-β表达为阴性,3例NK/TCL表达较低,这3种类型的淋巴瘤尽管临床表现不一,但是组织和血浆中TNF-β表达水平较低｡可能TNF-β在这些类型淋巴瘤中起的作用较小,详细的机制不清,也未见相关文献报道,有待于扩大样本含量进一步的研究｡TNF-β在LBL组织与血浆中表达水平较低,本研究中8例LBL中有6例为急性白血病患者,导致机体内TNF-β分泌减少,可能与这些患者机体免疫功能低下有关;也可能在患者的血浆中存在者某些加速TNF-β灭活的机制,对于这一结果还有待于进一步的探讨｡本研究中5例淋巴结反应性增生滤泡生发中心细胞(含较多的中心细胞和中心母细胞)､副皮质区的免疫母细胞､毛细血管内皮细胞呈弱阳性,而套区､副皮质区小淋巴细胞呈阴性｡中心细胞､中心母细胞和免疫母细胞为受到抗原刺激后的转化细胞,是处于高增殖状态的细胞,TNF-β参与淋巴细胞转化过程,进一步证明TNF-β在淋巴细胞的转化过程中起着重要的作用｡

IPI评分作为预后综合指标已广泛用于临床,对判断预后,指导治疗具有重要意义[16]｡组织中TNF-β表达与IPI评分的中､高危组有关,差异有统计学意义(P0.05);而血浆TNF-β水平与临床不同指标之间无关｡对于这一结果作者认为可能与TNF-β具有促肿瘤和抗肿瘤的双重作用有关｡在组织中TNF-β表达以肿瘤细胞阳性为标准,自分泌TNF-β主要起促肿瘤作用,故TNF-β在组织中高表达提示预后差｡而血浆中所测得的是总TNF-β水平,为肿瘤细胞自分泌和血管内皮细胞､吞噬细胞旁分泌TNF-β的总和,血浆TNF-β水平与临床不同指标的关系是二者综合作用结果,因此,血浆TNF-β水平对临床判断预后的意义不大｡TNF-β在不同类型淋巴瘤组织与血浆中表达无相关性,说明TNF-β自分泌与旁分泌作用存在复杂的机制,其表达水平存在明显的差异｡

综上所述,TNF-β在淋巴瘤组织和血浆都有不同程度表达,提示TNF-β在淋巴瘤发生､发展中起到一定作用,但是TNF-β与淋巴瘤的关系比较复杂,不同的亚型可能存在不同的机制,有必要进一步研究,探讨其详细机制｡

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Expression of TNF-βin subtypes of lymphoma and its significance*

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1.,,,,830054,;
2.,,,830000,)

ObjectiveTo investigate the expression of tumor necrosis factorβ(TNF-β)in tissue and plasma of subtypes of lymphoma and its significance.MethodsImmunohistochemical technique and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)were respectively used to assess the expression of TNF-βin 97cases paraffin tissue and plasma samples of subtypes of lymphoma.ResultsExpressions of TNF-βwere higher in HL,DLBCL,PCN,SLL/CLL,FL and PTL then in LBL,and NK/TCL.Expressions of TNF-βin tissue of subtypes of lymphoma had not significant difference(P0.05).Expression of TNF-βin plasma of HL,DLBCL,PCN,SLL/CLL,FL and PTL were higher than control group,TNF-βin these lymphoma were significant difference(P0.05).Expressions of TNF-βin tissue had significant difference between low-risk group and middle or high risk group of international prognosis index(P0.05).Expressions of TNF-βin tissue and plasma of subtypes of lymphoma had no correlation(rs=0.12,P0.05).ConclusionTNF-βhas been found various degree expressions in tissue and plasma of lymphoma,TNF-βplay a role in the development of lymphoma,but the expression of TNF-βin subtypes of lymphoma may exist different mechanisms.

lymphoma;tumor necrosis factors;tissues;plasma

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.004

A

1671-8348(2012)18-1795-04

* 基金项目:国家自然科学基金支持项目(30860096)｡△

,E-mail:guxia1373@sohu.com｡

2011-03-17

2011-12-21)

•临床研究•