医疗器械免疫原性评价与试验策略

【作 者】刘成虎，吴平，施燕平，王敏

1 国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心

2 山东省医疗器械生物学评价重点实验室

3 山东恒信检测技术开发中心

近年来，随着医疗器械生物学评价方法学研究的不断深入，医疗器械免疫毒理学的研究已逐渐成为医疗器械生物学评价的热点领域之一。众所周知，医疗器械中含有的免疫原是导致其免疫毒性的原因。因此，如何对医疗器械中含有的免疫原进行评价是控制相关产品免疫毒性的关键所在。有鉴于此，ISO/TC194 于2006年就推出了ISO/TS 10993-20《医疗器械免疫毒理学试验原则和方法》[1]，然而，由于应用于医疗器械的免疫毒理学方面的标准化试验尚未不成熟。因此，在该ISO技术规范中没有给出具体的试验方法。本文通过对医疗器械的免疫毒理学知识的介绍，以期能帮助大家对医疗器械免疫学评价的理解，更好地使用ISO/TS 10993-20，从而为建立一套完整的医疗器械免疫原性风险评价体系，有效降低医疗器械临床使用时的免疫毒理学风险奠定基础。

1 医疗器械中免疫原引起的免疫毒性效应

医疗器械中含有的免疫原是其引发免疫毒性反应的根本原因。免疫原是可能会刺激机体发生免疫应答的异源性物质。在考虑医疗器械中免疫原潜在的免疫毒性危害时，应充分考虑器械与人体的接触方式、接触时间对免疫毒性效应的影响。GB/T16886.1/ISO 10993-1中所列出的每一种接触方式都有可能引起免疫毒性反应[2]。其中，皮肤和粘膜接触可能诱发I型和IV型超敏反应。不含免疫原物质的器械与机体长时间接触也有可能在机体内产生免疫原，一般来说，接触时间越长，产生的免疫原的可能性越大。与机体接触24 h以上的器械发生免疫应答反应也可被认为是具有免疫原性。

1.1 超敏反应

超敏反应一般分为四种类型。常见的由医疗器械引发的超敏反应主要有两类。即由IgE抗体介导的Ⅰ型超敏反应（速发型超敏反应）和由T淋巴细胞介导的Ⅳ型超敏反应（迟发型超敏反应）。Ⅰ型超敏反应也是最严重的超敏反应。Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应涉及到抗体（IgG或IgM，但是没有IgE）和补体，发生率相对较低，医疗器械一般不会发生这两种超敏反应。

1.2 慢性炎症反应

众所周知，炎症是局部损伤后的修复反应，是机体的一种保护机制。其中，急性炎症反应一般持续时间较短，并伴有机体局部的红肿热痛和功能障碍。与急性炎症反应不同，慢性炎症反应一般可持续数月或更长时间，其特征为巨噬细胞和淋巴细胞浸润，并形成免疫性肉芽肿和更为严重的免疫毒性反应，如自身免疫性疾病等。对于长期接触或永久性植入物导致的慢性炎症，还有可能导致植入物的成分与骨质相连，形成致密的假性囊腔及其它严重后果。GB/T16886.6/ISO10993-6中对植入后局部炎症反应作出了详细地描述[3]。

1.3 免疫抑制

免疫抑制可导致机体适应性免疫应答的抑制，宿主抵抗力下降和经常性的严重感染。截至目前，尚无器械/材料导致免疫抑制的确切证据，与免疫抑制相关的免疫毒理实验还是仅限于一般的毒性测试阶段。

1.4 免疫刺激

免疫刺激主要为器械/材料中的免疫原性成分刺激机体产生的免疫应答(如抗体和/或淋巴细胞对外源蛋白的免疫应答)。一般情况下，免疫刺激不会导致机体对疾病的抵抗力降低。然而，不适当的抗原特异性或非特异性刺激免疫系统，有可能会加剧现有的过敏或自身免疫症状。

1.5 自身免疫

某些器械/材料接触人体后，可与组织或血清蛋白结合，改变蛋白的构象，使得机体可对这些修饰后的自身抗原进行识别，产生自身抗体或T淋巴细胞与宿主的自身抗原发生反应，导致细胞损伤或组织破坏，并可能导致慢性、消耗性自身免疫性疾病，或重要组织和器官的损伤。自身免疫一般表现为较高的个体差异性，影响因素众多，并且由于种属间有差异性，很难用动物模型进行模拟。

2 含免疫原的医疗器械产品类型

在医疗器械的众多组分中，蛋白质作为免疫原性物质的可能性最大，其次是多糖、核酸和脂质。小分子量的物质通常没有免疫原性，然而，它们可以通过与宿主蛋白结合并改变蛋白的构象来获得免疫原性。生物源性的材料，如胶原，乳胶蛋白和动物组织中含有的免疫原都有可能刺激机体发生免疫应答。常见的含免疫原的医疗器械主要包括以下几种类型。

2.1 组织工程类产品和同种异体移植物

组织工程类产品和同种异体移植物是近年来发展较快的一类医疗器械类产品。机体针对该类产品发生的免疫毒性反应主要为移植排斥反应。其中，最常见的是同种异型移植排斥反应，即由受者的T细胞介导的，针对该类产品中的免疫原进行的免疫应答，主要涉及直接识别和间接识别两种机制（见表1）。因此，组织工程类产品和同种异体移植物在加工过程中，除了要对潜在的病毒感染因子进行灭活以外，另一项很重要的工序就是去除或降低产品的免疫原性，减少产品使用过程中发生的急性和慢性排斥反应，以保证产品发挥其预期的功能。

表1 直接识别和间接识别的比较Tab.1 Comparisons between direct recognition and indirect recognition

2.2 动物源类产品

医疗器械中来源于动物组织的材料非常范围，这些材料可构成器械的主要部分(如牛/猪心脏瓣膜、用于口腔科或整形外科的骨替代物、止血器械）、产品的涂层或浸渗（如胶原、明胶、肝素）或用于器械制造过程（如油酸盐和硬脂酸盐等动物脂衍生物、胎牛血清、酶、培养基）。这些产品在使用过程中，产品中残留的动物组织蛋白、DNA以及包膜抗原等都可能会与患者的免疫系统发生反应，产生免疫毒理学效应，其实质也为机体免疫系统针对异种移植物的排斥反应。因此需在加工过程中对其免疫原性进行清除或降低。

2.3 乳胶类产品

乳胶产品中由于含有乳胶蛋白质，当人体接触后，蛋白可选择诱导特异性B细胞发生IgE抗体应答，产生表面结合特异性IgE的致敏肥大细胞/嗜碱性粒细胞。当机体再次接触相同的乳胶蛋白时，会与致敏肥大细胞/嗜碱性粒细胞表面的IgE抗体结合，从而引发Ⅰ型超敏反应。目前已经证实，天然乳胶中的几种蛋白质能与IgE结合，并可以引发Ⅰ型超敏反应[4]。

2.4 聚合物、陶瓷制品及金属

对于医疗器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金属材料中潜在的可沥滤物、磨损或可降解成分，可与宿主蛋白结合而具有免疫原性。以金属材料为例，金属医疗器械中可引起超敏反应的金属有很多种，主要有镍、钴、铬、汞等。其中，镍所引起的金属过敏最为常见。镍可极少量溶解于人的体液中，并与组织中的蛋白质结合，改变组织蛋白的构象，从而被机体的抗原递呈细胞识别、加工和处理，以抗原肽和MHC-II/I类分子复合物的形式表达于抗原递呈细胞表面，进而活化具有相应抗原受体的CD4+T细胞和CD8+T细胞，并在细胞因子作用下增殖分化为效应T细胞或记忆性T细胞。当记忆性T细胞再与镍蛋白复合物接触后，即可迅速增殖分化为效应T细胞，从而引发Ⅳ型超敏反应。同时，有些金属（如镍和汞）也可能在某些受试者体内引发免疫抑制，但具体机制不详。

3 医疗器械免疫原性评价策略

当前生物相容性试验中免疫原性方面的知识非常有限的。一方面缺少简单、可靠和敏感的方法。另一方面，虽然有些免疫学实验已被证实为有效的方法，但是在许多情况下，其生物学意义和预示价值仍需要慎重考虑。与其他医疗器械生物相容性试验相似，免疫原评价方法也分为体外试验、半体内试验和动物试验三种方式。其中，最为重要的就是通过在啮齿类动物体内试验的方法来研究和评价材料的免疫学效应。同样，在进行动物实验时，为了与GB/T 16886.2/ISO 10993-2中的要求一致，我们需要考虑到所有可能的和实际上能做到的替代方法[5]。从试验性质上看，免疫原评价的方法又可分为非功能性试验和功能性试验两种类型。预期构建的免疫原性评价的框架如图1所示。

图1 免疫原性评价的框架Fig.1 Framework for immunogenic evaluation

3.1 非功能性试验

非功能性试验主要是针对免疫器官重量，大体形态，淋巴组织的改变程度，淋巴细胞的数量和免疫球蛋白的水平以及其他免疫功能指标水平的改变加以描述。它是目前采用广泛的评价方法。

3.2 功能性试验

非功能试验具有易操作、检测迅速的特点，然而，要想全面客观的评价医疗器械的免疫毒性，就必须进行相关的功能性试验研究。功能性试验是用来检测细胞和/或器官的活性，大体分为体液免疫应答和细胞免疫应答两大类。前者常见的试验有使用酶联免疫吸附试验（ELISA）对免疫球蛋白功能的检测以及补体活性的检测。后者常见的试验有淋巴细胞对丝裂原或特异性抗原的增殖反应，混合淋巴细胞反应，自然杀伤（NK）细胞的活性以及致敏试验等。

4 结语

目前，医疗器械导致人体潜在免疫毒性作用方面的全身研究是非常缺乏的，部分原因可能是因为在材料的早期研发阶段就已经进行了免疫原性的筛选。但是，缺乏科学、完整的适用于医疗器械免疫原性评价程序和试验方法学标准体系也是不容忽视的原因。同时，随着大量新型医疗器械的不断涌现，以及新的免疫学技术如流式细胞术、蛋白质组学及基因芯片技术等在医疗器械免疫原性评价中的应用，使我们对医疗器械中免疫原的识别以及其基本分子结构进行定性分析成为可能。相信将来也一定会形成一套能有效保证医疗器械免疫原性安全的检测方法学标准体系。

[1] ISO/TS 10993-20:2006, Biological evaluation of medical devices–Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical device [S].

[2] ISO 10993-1:2009, Biological evaluation of medical devices–Part 1: Evaluation and testing within a risk management process [S].

[3] ISO 10993-6:2007, Biological evaluation of medical devices-Part 6:Tests for local effects after implantation[S].

[4] Akasawa A, Hsieh L-S, Lin Y, Serum reactivities to latex proteins(Hevea brasiliensis)[S]. J Allergy Clin Immunol 1995, 95:1196-1205.

[5] ISO 10993-2:2006, Biological evaluation of medical devices-Part 2:Animal welfare requirements[S].