腺苷－磷酸激活的蛋白激酶与细胞增殖

张姣姣，王 怡，杨炜蓉，汪 勇，王莉娟，王鲜忠

（西南大学动物科技学院 重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆 北碚 400716）

腺苷－磷酸激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是一种能被腺苷－磷酸（AMP）激活，主要协调代谢和能量需要的蛋白激酶［1］；当体内能量状况发生改变时，ATP分解为ADP、AMP并激活AMPK，并通过AMPK调节糖原、胆固醇和脂肪的合成，减少ATP的利用，同时利用ADP再合成ATP为机体补充能量，以保持机体的能量平衡，这一途径在动物生理、营养、环境和疾病过程中起着重要作用。最近的研究表明，AMPK还可以通过负调控细胞周期的进程调节细胞增殖，抑制肿瘤细胞的增殖［2］。

1 AMPK的结构特征

AMPK 是一个由α（63kD）、β（30kD）和γ（37～63kD）亚基形成的异源三聚体，存在于所有真核生物中［1］。α为催化亚基，主要负责将ATP的磷酸传递至靶蛋白（如糖原合成酶、心脏型和诱导型磷酸果糖－2－激酶等）。α亚基含有一个N端激酶结构域和一个C端结构域，N端和C端之间为自抑制序列（autoinhibitory domain，AI）。α亚基包括 α1和α2，α1主要分布于肾、肝、肺、心脏和脑；α2主要分布在骨骼肌、心脏和肝脏中；β亚基为调节亚基，主要调节酶活性和亚基的细胞定位。β亚基N末端含有N－异淀粉酶结构域，β亚基的中心区域有一个糖原结合域（glycogen binding domain，GBD）。β亚基有β1和β2两种同工型，β1具有广泛的组织分布性，而β2主要分布在骨骼肌、心脏和胰腺中。γ亚基有4个串行重复的胱硫醚β－合酶（cystathionineβ－synthase，CBS）结构域，又称为“Bateman区”。γ亚基包括γ1、γ2和γ3三种同工型，γ1、γ2广泛分布于各组织细胞，γ3仅在骨骼肌中高表达。

2 AMPK活性的调节

2.1 依赖AMP的激活途径 AMPK的活性主要受细胞中 AMP/ATP比值的调控。AMP是AMPK的特异性激活剂，一方面AMP直接作用于AMPK，变构激活 AMPK，AMP能够直接与AMPKγ亚基的Bateman区结合，引起AMPK三聚体结构改变，增加 AMPK活性［1］；另一方面，AMP与AMPK结合后成为其上游激酶（AMP－activated protein kinase kinase，AMPKK）的底物，AMPKK再通过磷酸化AMPKα亚基上的Thr－172激活AMPK。

2.2 不依赖AMP的AMPK激酶途径 AMPK的活性还受到其上游激酶AMPKK的调节。LKB1（liver kinase B1）和 CaMKK（calmodulin－dependent protein kinase kinase）是两个主要的 AMPKK。Sakamoto等研究小鼠肌肉组织AMPK活性发现，当控制LKB1仅表达正常水平的10%时，AMPK的磷酸化和活化显著降低［3］。在敲除LKB1的小鼠胚胎成纤维细胞中，CaMKK能够通过磷酸化激活AMPK［1］。

近来研究还发现了另外两种AMPKK：转移生长因子β－激活激酶1（transforming growth factor－b－activated kinase，TAK1）和共济失调毛细血管扩张症突变基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）［1］。

2.3 其他激活因素 除了以上因素，在骨骼肌中，AMPK可被高浓度的肌酸激活而被高浓度的磷酸肌酸抑制［1－2］。瘦素和脂联素均能通过下丘脑－交感神经系统轴磷酸化激活 AMPK［1］。此外，5－氨基－4甲酰胺咪唑核糖核苷酸（AICAR）在细胞内磷酸化成AMP的类似物5－氨基咪唑－4甲酰胺核糖核苷，进而磷酸化激活 AMPK［4］。二甲双胍、ONO0－、高渗应激激活 AMPK时，AMP/ATP比值没有增加［2］。

3 AMPK调节细胞增殖的可能机制

细胞增殖的重要环节在于G1/S点的调控。G1/S调控点的中心成分是 Rb（retinoblastoma tumor suppressor protein Rb）蛋白，在通常情况下Rb蛋白处于低磷酸化状态，与核转录因子E2F1结合，当Rb蛋白被上游激酶磷酸化后，释放出E2F1，游离的E2F1进入核内结合相关基因启动子区，使E2F1调控的基因PCNA（proliferating cell nuclear antigen）、cyclin E表达增强，促进细胞进入S期。调控Rb蛋白的上游激酶主要包括细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitors，CDKIs）。当cyclins与CDKs结合后，形成cyclins－CDKs激酶复合物，使Rb蛋白磷酸化，促进细胞增殖；当CDKIs与CDKs结合后，抑制cyclins－CDKs激酶活性，使Rb蛋白处于低磷酸化状态，抑制细胞增殖。

3.1 AMPK通过调节p53－p21－p27轴，使细胞周期停滞 p53是一种肿瘤抑制因子，p53蛋白对细胞周期的作用是间接的，主要通过促进p21基因的转录，增加p21蛋白的合成间接抑制细胞周期。但也有研究认为，p53蛋白可直接与DNA复制过程中单链结合蛋白增殖细胞核抗原相互作用抑制DNA复制，阻止细胞分裂，使G1期停滞。近来研究发现，p53还可能通过调节miRNAs水平参与细胞增殖［5］。p21和p27都是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKIs），几乎能与所有的cyclins/CDKs复合物结合，抑制cyclins/CDKs激酶复合物的活性，使细胞不能通过G期。

Shariat等对膀胱癌组织进行p53、p21、p27和Rb检测，发现这4种蛋白在判断膀胱癌的生物学行为上具有协同作用［6］；研究胃癌组织中p53、p21、p27和Rb蛋白表达的情况也发现，p53、p21、p27和Rb蛋白表达之间在胃癌发生、发展中均呈正相关，这也就暗示了p53、p21和p27在抑制细胞增殖方面可能具有协同作用。进一步的研究发现，激活AMPK可以引起p53蛋白在Ser－15位点磷酸化而引起p53蛋白累积，进而增加CDKIs的表达量，抑制各类肿瘤细胞的增殖［5］。Rattan等的体外和体内试验均表明，通过AICAR激活AMPK增加了p53、p21和p27的蛋白表达量，并抑制各类癌细胞的增殖［4］。

3.2 AMPK通过抑制mTOR活性来抑制细胞增殖 mTOR（mammalian target of rapamycin）是保守的丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶，主要调控细胞生长和细胞分化，激活的mTOR可促进其下游的核糖体S6蛋白激酶（S6K）和转录起始因子4E结合蛋白1（elongation factor 4binding protein，4EBP1）的表达量增加，从而调控翻译的起始步骤，促进细胞增殖与分化。

AMPK的激活将抑制mTOR信号转导。激活的AMPK一方面可能从多位点磷酸化GAP，经TSC1/TSC2 （tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）途径抑制 mTOR 的活性［7］；另一方面可以通过直接磷酸化mTOR的Thr2446位点，阻止mTOR激酶催化结构域与底物的结合。此外，AMPK还可以抑制Akt磷酸化mTOR的Ser2446位点。Kimura等用AMPK的激活剂AICAR处理肉瘤病毒40感染的人类角膜上皮细胞，发现抑制了S6K的活性［8］。这些结果表明，AMPK可能通过调控mTOR影响细胞的增殖。

3.3 AMPK激活TSC1/2影响细胞增殖 肿瘤抑制复合物TSC是由TSC1和TSC2形成的二聚体，其中TSC2具有GTP酶活化蛋白（GAP）活性，可以负性调节小GTP酶Rheb（ras－homolog enriched in brain）的活化状态，而Rheb是mTOR的激活蛋白，所以TSC2进而抑制mTOR信号通路，负调节细胞生长和蛋白合成。研究显示，活化的AMPK作用于TSC1/TSC2，结合TSC2的C端并磷酸化其T1227和S1345位点［7］，增强TSC2的活性，进一步抑制mTOR，使蛋白质翻译减少，抑制细胞增殖。利用酵母双杂交的研究发现，Grb2（growth factor receptor bound protein 2）介导了AMPK的β1亚基与TSC2的相互作用，参与了AMPK对TSC2的磷酸化调控，抑制mTOR的活性［7］，这也进一步表明，AMPK可能激活TSC1/2抑制细胞增殖。

3.4 其他方式 FAS（fatty acid synthase）是脂肪酸合成过程中的限速酶，，许多肿瘤细胞中脂肪酸合成酶FAS过量表达，抑制FAS可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡。而有研究表明，活化AMPK可抑制FAS基因的表达，而且肝细胞中AICAR活化AMPK可抑制FAS的mRNA丰度，从而抑制肿瘤细胞增殖［4］，这提示AMPK可能通过抑制脂肪酸的合成来抑制细胞增殖。另外，Christine等研究发现，小鼠肝脏组织中miR－122抑制不仅增加了脂肪酸的氧化，还增加了AMPK的活性［9］。miRNAs具有抑制转录后基因表达的作用，在细胞增殖、分化、凋亡等一系列过程中发挥重要作用。这提示AMPK有可能通过miRNAs水平影响细胞增殖。

4 结语

AMPK是机体许多生命过程的参与者，关于AMPK的研究正往更深的领域发展。AMPK能够通过多种途径影响细胞增殖，对AMPK调节细胞增殖的作用机制仍有待于进一步研究。如果证实AMPK可以通过影响miRNAs的表达来调控细胞增殖，这无疑将为临床上治疗肿瘤找到新的突破口。

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