重庆后山栀子的UPLC-PDA指纹图谱研究
2012-01-26陈绍成石燕红杨娜王瑞
陈绍成,石燕红,杨娜,王瑞*
(1.重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆400067;2.上海中医药大学中药学院,上海201203)
栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果实,具有泻火除烦,清热利尿,凉血解毒的功效,用于热病心烦、黄疸尿赤、血淋涩痛、血热出衄、目赤肿痛、火毒疮伤、外治扭挫伤痛[1]。
已有文献报道栀子的化学成分有环烯醚萜类、有机酸类、西红花(藏红花)苷类、黄酮类等[2-4],具有保肝利胆、抗炎、镇痛、降血脂、抗病毒和抗肿瘤等药理作用[4-6]。以栀子苷、西红花苷-1为代表的环烯醚萜类和西红花苷类成分是栀子中公认的主要活性成分,目前对栀子及其加工炮制品的质量控制主要是根据这两类化合物含有量高低来进行评价[1,7-9]。
由于栀子品种比较复杂,市场上常以茜草科栀子属其它植物的果实冒充正品栀子出售[10-11]。近几年来,四川、重庆地区市售栀子均来自重庆市万州区后山镇,但该地所产栀子成熟果实超过半数明显大于现行2010年版《中国药典》栀子“性状”项下规定的长1.5 cm~3.5 cm和直径1 cm~1.5 cm,当地药商认为其性状不符合药典规定,市场销售前景不佳,使得重庆后山地区栀子栽培面积大大减少,对当地经济的发展造成了较大的影响。为了尽快推进重庆地区中药特色经济,保护栀子种质资源,有必要对该地区栀子作进一步研究。
本实验连续收集2009年—2011年重庆后山栀子9批,按栀子果实大、小分类;同时收集栀子对照药材、市售栀子和焦栀子各3批(非重庆后山产),采用可变波长法,建立了超高效液相色谱指纹图谱分析方法,并结合化学统计方法(SA、PCA),旨在通过比较与分析重庆后山栀子与其他产地栀子及栀子炮制品样品间的差异,来综合评价重庆后山产栀子的内在质量,为当地政府部门发展栀子产业提供技术支撑,且为其栀子人工栽培以及进一步的合理开发利用提供一定的科学依据。
1 仪器与试药
Waters Introduces ACQUITY UPLC H-Class System(包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站);乙腈(色谱纯,德国Merck公司);电子分析天平(AE200,瑞士METTLER TOLEDO公司),KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
乙腈、磷酸(色谱纯,Merck公司),水为Milli-Q超纯水(Millipore,美国Bedford公司);甲醇、乙醇等其它分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司(中国,上海)。
栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110749),西红花苷-1对照品(上海中药标准化研究中心,经HPLC检测,面积归一化法计算,纯度>98%)。
本实验收集重庆后山栀子9批,按果实的外观形态划分为大、小2个级别[11],其中大果实长度>3.5 cm,直径>1.5 cm;小果实长度和直径均符合现行2010年版《中国药典》栀子“性状”项下规定的标准(S01~S18),市售栀子药材3批(S19~S21),栀子对照药材1批(S22)和市售焦栀子3批(S23~S25)。样品和标本由重庆第二师范学院陈绍成副教授和上海中医药大学石燕红收集(表1),药材由上海中医药大学宋龙博士鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果实,标本保存在上海中医药大学。样品粉碎,过三号筛,抽真空保存。
2 方法
2.1 色谱条件Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脱,0~4 min(8%~20%A),4~11 min(20%~60%A);检测波长238 nm(0~5 min),440 nm(5~11min);体积流量0.3 mL/min;柱温30℃;进样量2 μL。
表1 不同批次栀子样品来源及相似度结果(n=2)Tab.1 Sample resources and the results of sim ilarity(n=2)
2.2 样品溶液制备方法
2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取栀子苷和西红花苷-I对照品适量,加甲醇制成每1 mL各含40 μg的混合对照品溶液,即得。
2.2.2 供试品溶液的制备取栀子样品粉末约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇20 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用70%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验取栀子样品(S01)粉末约0.5 g,精密称定,按供2.2.2项操作,照2.1项色谱条件下连续进样6次测定,结果表明,UPLC图谱中各主要色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.19%,相对峰面积的RSD均小于2.45%,表明仪器的精密度良好。
2.3.2 重复性试验取同一批号栀子样品(S01)粉末约0.5 g,共6份,精密称定,按2.2.2项操作,照2.1项色谱条件下进样测定,结果表明,UPLC图谱中各主要色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.56%,相对峰面积的RSD均小于4.91%,表明该方法重复性良好。
2.3.3 稳定性试验取同一栀子样品(S01)粉末约0.5 g,精密称定,按2.2.2项操作,照2.1项色谱条件,分别于0、4、8、12、24、48 h进样分析,结果表明,UPLC图谱中各主要色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.55%,相对峰面积的RSD均小于3.89%,表明样品溶液在48 h内稳定。
3 结果与分析
3.1 栀子UPLC指纹图谱建立标准采用优化的实验方法,建立了9批重庆后山栀子药材(按果实大小分类)的UPLC指纹图谱。以“对分类决策有影响的信息应尽量保留,对分类决策无影响的信息应尽量舍弃”的原则筛选了18个色谱峰;并采用对照品比对,峰6和峰11分别为栀子苷和西红花苷-1。以特征性活性成分栀子苷(峰6)为参比峰,采用“中药指纹图谱相似度评价系统2.0版”软件生成模式指纹图谱,手动标定18个共有峰(图1,图2),并采用SPSS 15.0和偏最小二乘法软件(SIMCA-P 11.0)对其进行化学统计方法分析。
3.2 指纹图谱结果分析
3.2.1 相似度分析采用“中药指纹图谱相似度评价系统2.0版”软件生成标准对照图谱,SFDA规定以所有色谱图的相关系数和/或原始数据的夹角的余弦值计算其相似度,结果见表1。
3.2.2 主成分分析主成分分析是一种掌握主要矛盾的统计方法,通过线性变换将多变量指标转化为少数几项综合指标,所得出的少数几个主成分因子,要尽可能多地保留原始变量的信息,且彼此不相关[15-16]。主成分分析和主成分负载图结果见图3和图4。
4 结论与讨论
4.1 检测波长的选择环烯醚萜类和西红花苷类为栀子中两大主要有效成分,最大吸收波长分别为238 nm和440 nm,前期预实验时以单波长238 nm和440 nm分别进行了UPLC-PDA分析,对比分析所采集的UPLC图谱得出:紫外吸收光谱扫描显示环烯醚萜类成分主要集中在0~5 min,西红花苷类成分集中在5~11 min,两者无交叉吸收区域,据此,我们选用可变波长技术,分别在二者最大吸收波长处检测,使两者成分在同一指纹图谱条件中呈现出来。本研究采用可变波长超高效液相色谱法首次建立了重庆后山产栀子的指纹图谱,方法简便,稳定可靠,重复性好。
图1 栀子对照品(A)与药材(B)UPLC色谱图Fig.1 UPLC chromatogram s of referenu substances(A)and the samples of Gardeniae Fructus(B)
图2 25批栀子样品的UPLC-PDA指纹图谱Fig.2 UPLC fingerprints of 25 batches of samp les of Gardeniae Fructus
图3 主成分分析得分图Fig.3 Scores plot obtained by PCA of the 25 samp les
图4 主成分因子负载图Fig.4 Loading plot from PCA for the common
4.2 相似度分析不同产地栀子药材的相似度为0.977~0.998,表明在该指纹图谱识别模式下所收集的重庆后山栀子药材与市售的栀子药材和对照药材间差异性较小。焦栀子的相似度为0.955~0.957,表明焦栀子与栀子药材间存在一定的差异,可能与栀子的炮制有关。对所标定的18个共有的相对保留时间(RRT)和相对保留峰面积(RPA)分别进行了分析,RRT的RSD小于1.5%,而RPA的RSD最高达到206.1%,且各相似度均大于0.95,由此可以认为不同批次样品中主要化学成分的组成相似,但相对比例存在明显差异,这可能与栀子药材的生长环境(产地、气候、土壤等)、采收加工工艺和炮制工艺等诸多因素有关[13]。
2009—2011年产重庆后山栀子间相似度为0.977~0.998,平均相似度为0.991,RSD为0.67%,与栀子对照药材的相似度(0.997)较为接近。连续3年采收的样品间无明显差异,不同类型(大、小类)具有高度的相似性与一致性,其结果提示重庆后山地区适宜栀子生长,且栀子的内在质量与其他产地间的栀子无显著差异。
4.3 主成分分析所有的样品被清晰地划分为三大类(图4),S01~S17和S22被划分为第Ⅰ类,主要为重庆后山栀子和栀子对照药材;S23~S24为第Ⅱ类,为市售焦栀子;S19~S21为第Ⅲ类,为市售的商品栀子药材。其主成分分析、相似度结果与实际收集的样品情况基本一致,表明在该指纹图谱识别模式下,主成分分析能较好地区分重庆后山栀子与其他产地栀子及炮制品焦栀子。主成分负载图(图4)表明,变量6(峰6,栀子苷)和变量11(峰11,西红花苷-I)对主成分得分结果影响最大。其结果表明:环烯醚萜类成分栀子苷和西红花苷类成分西红花苷-1含有量比例的差异可能是造成不同样品间差异的主要因素,这也是造成各主要共有峰RSD差异较大的主要原因。
4.4 基于UPLC-PDA技术,通过指纹图谱结合化学统计方法(SA和PCA)对重庆后山栀子与栀子对照药材和其他产地市售栀子药材比较研究发现:重庆后山栀子大、小果实级别间具有较高的相似度;三者间没有显著差异,且相似度均大于0.97,其主要差异表现在有效活性成分环烯醚萜类(栀子苷)和西红花苷类(西红花苷-I)的含有量上。
4.5 在前期研究工作中,对所收集的栀子样品中主要药效成分栀子苷和西红花苷-I进行定量分析:栀子对照药材中栀子苷质量分数为36.68 mg/g,西红花苷质量分数为2.42 mg/g;重庆后山栀子中栀子苷质量分数为31.01~44.09 mg/g,西红花苷-I质量分数为1.07~4.01 mg/g;市售栀子中栀子苷质量分数为32.38~45.47 mg/g,西红花苷-I质量分数为2.64~4.93 mg/g;市售焦栀子中栀子苷质量分数为24.42~30.30 mg/g,西红花苷-I质量分数为0.06~1.13 mg/g。实验结果表明重庆后山栀子与栀子对照药材中主要药效活性成分栀子苷与西红花苷-1的含有量较为接近,而与市售的栀子及其焦栀子间存在一定差异,初步认为这是造成指纹图谱中所有样本被划分为三大类的主要原因。
4.6 本研究对合理评价与控制重庆后山栀子的内在质量奠定了一定的基础,为当地药商的不合理推断栀子的质量提供了参考依据,认为重庆后山地区独特的生态环境适宜栀子的生长,建议合理规范栀子的种植、提高栀子的品质,从而来提高当地药农收入,加快推进重庆地区中药特色经济发展的步伐。
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:231-232.
[2]陈红,肖永庆,李丽,等.栀子化学成分研究[J].中国中药杂志,2007,32(11):1042.
[3]付小梅,侴桂新,王峥涛,等.栀子的化学成分[J].中国天然药物,2008,11(6):419-420.
[4]陈雁,张现涛,张雷红,等.栀子化学成分及药理作用研究进展[J].海峡医药,2011,22(12):1-5.
[5]方尚玲,刘源才,张庆华,等.栀子苷镇痛和抗炎作用的研究[J].时珍国医国药,2008,19(6):1373-1376.
[6]罗春丽,赵培,胡宏波,等.藏红花素对膀胱移形细胞癌的增值抑制作用[J].重庆医科大学学报,2008,33(11):1305-1308.
[7]张留记,刘钦松,屠万倩,等.RP-HPLC法同时测定不同产地栀子中栀子苷、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量[J].中国药房,2011,22(7):630-632.
[8]何兵,田吉,李春红,等.泸州纳溪GAP基地栀子中4种主要活性成分的含量测定[J].中成药,2009,31(12):1884-1887.
[9]胡开治,肖波,李品明,等.重庆卵圆形栀子的栀子苷含量测定与分析[J].西南大学:自然科学版,2010,32(2):86-90.
[10]付小梅,周光雄.栀子类药材的研究概况及展望[J].中国野生植物资源,2001(2):24-26.
[11]曹岚,梁芳,戴泽霞.江西新干产栀子种质资源研究初报[J].时珍国医国药,2008,19(4):794-795.
[12]何兵,田吉,李春红,等.可变波长建立泸州纳溪GAP基地栀子药材高效液相色谱指纹图谱[J].时珍国医国药,2010,21(4):941-942.
[13]曹娟,王福刚,刘克,等.白鲜皮药材HPLC指纹图谱研究[J].中成药,2011,33(9):1469-1472.
[14]田静,许亚玲,舒娟,等.梵净山仿野生天麻高效液相指纹图谱研究[J].中成药,2011,33(9):1472-1475.
[15]Liu M,Li Y G,Chou G X.Chromatographic fingerprinting analysis of Danshen Root(Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)and its preparations using high performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray mass spectrometry(HPLC-DAD-ESI-MS)[J].J Sep Sci,2007,30:2256-2267.
[16]孙振球,徐勇勇.医学统计学[M].北京:人民卫生出版社,2002,31(23):326-373.