九香虫三氯甲烷浸提物对两种癌细胞增殖和周期的影响

2012-01-26侯晓晖孙廷李晓飞

中成药 2012年12期

侯晓晖，孙廷，李晓飞

(遵义医学院，贵州遵义563000)

九香虫Aspongopus chinensisDallas，隶属于半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae，俗称黑兜虫、打屁虫、屁板虫、屁巴虫等，分布于我国云南、贵州、四川等省，为我国特有种［1］，是一种重要的中药昆虫。《本草纲目》早有记载:“咸，温，无毒，用于膈脘滞气、脾肾亏损、壮肾之阳”［2］。近年有报道称，九香虫是一种抗癌昆虫，主治食管癌、胃癌［3-4］，但缺乏药理实验数据的支持。

本研究通过三氯甲烷冷浸法提取九香虫体内的有效成分进行体外抗人胃癌SGC-7901和肝癌HepG2细胞的实验，并初步推测抗癌活性成分在九香虫体内的存在形式，从而为其药用价值的深入开发提供实验数据和理论支持。

1 材料和仪器

1.1 九香虫标本采自贵州省遵义市习水县土城镇赤水河边，将标本置于烘箱中干燥后保存备用，实验前将其研磨成粉末。

1.2 细胞株胃腺癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepG2，均由遵义医学院中心实验室提供。

1.3 试剂RPMI 1640培养液(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青公司)、细胞周期与凋亡试剂盒(杭州碧云天生物技术有限公司)、胰酶(Solarbio)、二甲基亚枫(DMSO，Solarbio)、四甲基偶氮唑盐(MTT，Solarbio)，其余试剂均为国产分析纯。

1.4 仪器设备超净工作台(北京半导体设备一厂);CO2培养箱(美国SHELLAB公司);倒置显微镜(南京江南永新光学有限公司);台式低速离心机(上海医疗器械有限公司);台式冷冻恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)。

2 方法

2.1 三氯甲烷浸提物制备取九香虫粉末10 g，用60 mL三氯甲烷浸泡12 d，过滤、自然挥干，得到九香虫的粗提物浸膏。取此浸膏0.5 g，溶于0.5 mL的三氯甲烷中，充分溶解后过滤除菌，－20℃保存备用。

2.2 细胞培养与传代将SGC-7901和HepG2细胞置于37℃、饱和相对湿度5%CO2培养箱中常规培养，使用含10%胎牛血清及1%抗生素(青霉素100 mg/L和链霉素100 mg/L)的RPMI 1640培养基。细胞呈单层生长并铺满瓶底时，采用0.25%的胰酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

2.3 MTT试验取对数生长期的细胞，调整细胞密度至1×106/mL，将其接种于96孔板中待用［5］。实验设置给药组、空白对照组和阴性对照组，其中空白对照组为仅加入培养基，阴性对照组为加入含三氯甲烷的培养基，而给药组为加入九香虫三氯甲烷浸提物，设置6个不同浓度，并设6个重复(见表1)。按照实验需要加入100 μL含/不含药培养基。将细胞置于CO2培养箱中培养24 h后，加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，弃去上清液，加入DMSO 150 μL，振荡10 min。酶标仪检测吸光度(OD)值，并用下式计算肿瘤细胞生长抑制率及其IC［6］50，实验重复3次:

肿瘤细胞生长抑制率(%)=［1－D(K)给药组/D(K)对照组］×100%

IC50=Ig－1［Xm－I(∑p－0.5)］［D(K)代表OD值，K是变量，Xm为最大剂量对数值，P为细胞抑制率，∑p各组细胞抑制总和，I为相邻两组剂量比值的对数］。

2.4 显微镜观察细胞形态学变化将对数生长期的SGC-7901和HepG2细胞用胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于放置盖玻片的6孔培养板中，培养细胞爬片生长。培养24 h，待细胞在盖玻片上贴壁良好后，加入三氯甲烷浸提物处理细胞，观察细胞形态变化

2.5 流式细胞仪检测细胞周期收集给药组(2 000 μg/mL和1 000 μg/mL)和空白对照组细胞于离心管中，离心收集细胞;PBS洗涤，加入70%乙醇，置于4℃冰箱中固定36 h以上。收集细胞，PBS再次洗涤;避光条件下加入200 μL染色液(含RNase A的碘化丙啶染色液PI)，轻轻吹打均匀，温热30 min后，4℃放置备用。流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡，结果用CELLQuest软件分析。

2.6 统计分析利用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差即(±s)表示。

3 结果

3.1 显微镜观察细胞形态学变化九香虫三氯甲烷浸提物(500 μg/mL)处理SGC-7901和HepG2细胞24 h后，与空白对照组相比细胞数目明显减少。镜下可见空白对照组的细胞成群贴壁生长，细胞透亮、胞膜清晰、折光性好;而给药组贴壁细胞数量减少，细胞变圆，皱缩，与邻近细胞之间空隙加大，形成较多的细胞碎片(见图1)。

图1 九香虫三氯甲烷浸提物对SGC7901细胞形态的影响Fig.1 Effects of the crude extracts on the morphous of SGC7901 cells

3.2 三氯甲烷浸提物对SGC-7901和HepG2细胞增殖的影响MTT实验结果显示，三氯甲烷浸提物对SGC-7901和HepG2细胞具有明显的体外增殖抑制作用，并呈剂量依赖性(见表1、图2)。由上述IC50计算公式可知，三氯甲烷浸提物对两种癌细胞的IC50分别为1 193.52 μg/mL和964.34 μg/mL。

表1 九香虫三氯甲烷浸提物对SGC-7901和HepG2细胞增殖的抑制作用(±s，n=6)Tab.1 Effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells(±s，n=6)

三氯甲烷浸提物/(μg·mL－1)SGC-7901抑制率/%HepG2抑制率/%125 14.13±0.033 4 18.89±0.018 4 250 29.93±0.025 5 54.05±0.026 8 500 33.94±0.038 7 62.89±0.012 7 1 000 38.78±0.010 6 71.20±0.029 5 2 000 45.49±0.038 0 75.04±0.026 9 4 000 91.57±0.007 2 78.33±0.021 2

图2 九香虫三氯甲烷浸提物对SGC-7901和HepG2细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells

3.3 三氯甲烷浸提物对SGC-7901和HepG2细胞周期的影响流式细胞仪检测细胞周期结果显示，三氯甲烷浸提物的中剂量组(2 000 μg/mL)和高剂量组(4 000 μg/mL)处理细胞24 h后与对照组相比，HepG2细胞周期中各时相细胞数发生显著变化，而SGC-7901细胞周期的分布变化规律不明显(见图3、表2)。

HepG2细胞对照组G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例分别为57.66%、34.71%和7.63%;而中剂量组细胞比例分别为69.65%、24.92%和5.43%，高剂量组细胞比例分别为76.99%、16.91%和6.10%。由实验结果可知，给药组的S期细胞比例明显降低、G2/M期细胞变化不大，而G0/G1期细胞比例明显升高，与对照组相比差异具有显著性(P＜0.05)。

4 讨论

近年来，恶性肿瘤已逐步上升为第一大杀手，而胃癌和肝癌是我国常见的恶性肿瘤，临床主要以手术治疗合并术后放疗和化疗为主要治疗手段，但对晚期效果不佳。临床上不断探索新的抗癌药物的开发与应用，而九香虫作为我国特有的中药昆虫，

图3 九香虫三氯甲烷浸提物对HepG2细胞周期的影响Fig.3 Effect of the crude extracts on cell cycle of HepG2

表2 HepG2和SGC7901细胞周期各时相分布结果Tab.2 Results of DNA analysis on HepG2 and SGC7901 cells

有报道称其对食管癌、胃癌等有一定疗效［3］。本实验结果显示，九香虫三氯甲烷浸提物通过对细胞周期的影响，可抑制人胃癌SGC-7901细胞和肝癌HepG2细胞生长，且这一变化呈现剂量依赖性。尽管本研究中IC50较大，但究其原因应为本实验中使用的是九香虫的三氯甲烷浸提物而非纯品［7-8］。

肿瘤发生的基础是细胞生长和凋亡失调，由于细胞紊乱，从而导致肿瘤的发生。细胞周期机制的破坏是肿瘤发生发展的关键环节之一，细胞一旦从G1期跨入S期，则可以不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程［9］。本实验结果显示，HepG2细胞在药物作用后呈现G0/G1期的阻滞现象，这可能阻断了细胞生长、分裂，从而延长了细胞周期，这与植酸等阻滞HepG2细胞于G1期从而抑制细胞增殖相类似［10-11］。但是，其确切的分子机制将有待于进一步深入研究和探讨。

九香虫的三氯甲烷浸提物对两种癌细胞具有一定的抑制作用，由于三氯甲烷可提取九香虫体内的非极性成分(即脂类物质)，故可初步推断其抗肿瘤活性成分为此类物质，但由于此三氯甲烷浸提物成分复杂且纯度较低，故尚不能确定其为何种物质(即单一纯品)［12］。

迄今为止，人们对九香虫药用机理的研究少之又少，本实验正是根据传统中药药用价值的研究方法而展开研究，希望能为这一重要的中药昆虫——九香虫在临床防治肿瘤方面的应用提供理论基础。

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