微小RNA与缺血性脑损伤

张 煜，郭 军

南京医科大学基础医学实验教学中心，南京 210029

微小RNA与缺血性脑损伤

张 煜，郭 军

南京医科大学基础医学实验教学中心，南京 210029

微小RNA(miRNA)是一类高度保守的单链RNA，在机体发育代谢过程中发挥重要调节作用。中枢神经系统存在大量的miRNA，不仅与神经细胞的发育、分化和生理功能密切相关，在脑缺血后神经病变和功能失调中也发挥重要的调节作用。特定miRNA能通过自身水平变化影响缺血后其靶基因的表达，参与神经细胞保护机制以及凋亡再生机制的调控。充分了解脑内特异性miRNA的功能和调控机制，有助于从基因水平上为缺血性脑损伤的预防、诊断和治疗提供新的策略。

脑缺血;微小RNA;功能

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种由21～23个核苷酸组成的内源性非编码RNA，广泛存在于病毒和高等生物中且进化高度保守［1］。miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ (polⅡ)、核糖核酸酶ⅢDrosha和Pasha酶等作用下转变为成熟miRNA，并与RNA介导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex，RISC)结合。动物miRNA碱基通过与靶信使RNA(mRNA)不完全结合的方式在转录后负向调节靶miRNA表达，最终导致mRNA稳定性降低或翻译抑制，从而参与细胞的发生、增殖、分化、生长、代谢和凋亡等生物学过程的调控［2-3］。中枢神经系统存在大量的miRNA，这些miRNA不仅与神经系统的发育、分化和功能密切相关［4］，在脑缺血后神经病变和功能失调中也发挥重要的调节作用。揭示miRNA与缺血性脑损伤的关系，能为脑缺血疾病预防和治疗提供新的思路或途径。

脑内miRNA简介

通过对人和鼠的成体器官的miRNA表达谱分析发现，约50%的miRNA表达有组织特异性。研究显示miR-124在大鼠中枢神经系统的表达水平比其他器官高100倍，然而肌肉特异性miR-1在大鼠中枢神经系统的表达水平比在心肌和骨骼肌中低100～1000倍。此外，在脑内还发现高表达的miR-134和miR-138［5］。研究还揭示，脑组织特异性 miRNA在神经系统内差异性分布，如 miR-92b、miR-146b、miR-551b、miR-330*、miR-384和let-7g在大鼠海马区的表达明显高于皮质区［6］;对大鼠杏仁核、小脑、海马、下丘脑和黑质的miRNA分析显示，有48种miRNA在其中1个或者2个区域内的含量超过其他区域3倍，这暗示脑特异性miRNA在神经系统内有区域特异性功能［7］。此外，Smirnova等［8］研究发现，miR-124和miR-128主要表达于神经元，而miR-23仅局限于星形胶质细胞。miR-26和miR-29在星形胶质细胞中表达高于神经元。

特定miRNA在脑缺血后神经细胞中的表达变化与调控

缺血刺激下脑组织特异性miRNA的表达特点脑缺血是目前导致残疾和死亡最常见的原因之一［9］，miRNA被证实参与此过程。局灶性脑缺血可诱导大鼠脑组织特异性miRNA广泛而持续的变化。短暂性大脑中动脉闭塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中发现，短暂脑缺血后表达发生改变的miRNA占观察总数的20%，其中24种表达增强，23种表达减弱［10］。

此外，神经细胞内miRNA在脑缺血后表达存在时空特异性。与氧含量正常的神经细胞相比，神经元内miR-29b在幼鼠氧和葡萄糖剥夺 (oxygen and glucose deprivation，OGD)实验6 h后上调2倍，24 h后上调至4倍;miR-21在OGD 24 h后上调2倍;而星形胶质细胞内miR-29b和miR-21只在OGD 12 h之后上调。另外，miR-30b、miR-107和 miR-137仅在星形胶质细胞内表达改变［11］。上述现象可能与它们在脑中参与的生理过程不同以及缺血激活星形胶质细胞和神经元内的生化途径不同有关，具体机制尚不清楚。

miRNA参与缺血预处理神经细胞的保护 研究发现，脑缺血预处理3 h后miR-200家族选择性上调。miR-200家族的miR-200b、miR-200c和miR-429能针对脯氨酰羟化酶2(hypoxia inducible factor-prolyl hydroxylase，PHD2)发挥神经耐受作用。PHD2作为氧感受器，通过氧依赖性途径催化缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)特定脯氨酸残基发生羟化反应，从而介导HIF降解。HIF被发现在缺氧条件下对维持组织、细胞内环境稳定十分必要。此外，研究人员发现体外转染miR-200家族部分miRNA也能增强缺血性神经耐受。上述研究揭示，miR-200家族成员的早期活化通过PHD2基因沉默和随后HIF-1α的稳定来增强缺血性神经耐受［12］。

超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)是一种能消除生物体在新陈代谢过程中产生的自由基等有害物的活性物质。人体中SOD包括3类:SOD-1、SOD-2和SOD-3。体内缺血模型研究发现，miR-145可调控位于线粒体内的SOD-2蛋白的表达。大鼠MCAO模型中发现抑制miR-145活性可显著上调SOD-2表达水平，从而增强神经细胞对氧化应激的耐受［10］。

miRNA-21被认为是机体强抗凋亡因子，通过对大鼠预缺血处理2d后的RT-PCR分析发现，在脑缺血边界区域的神经细胞中，miR-21表达水平比同源对侧神经细胞高3倍。体外研究也证实，miRNA-21在皮质神经元中的过度表达能显著抑制OGD诱导的神经元凋亡。相反，由反义引物抑制作用所致的内源miR-21衰减却加剧了OGD后的细胞凋亡。miR-21的过度表达还能有效降低 Fas配体 (Fas ligand，FASLG)水平，FASLG是肿瘤坏死因子α家族的一员和诱导细胞凋亡的重要配体。上述研究结果表明，过度表达的miR-21能通过下调FASLG抑制凋亡发生，增强缺血性神经耐受，很可能被识别为一个重要的治疗缺血性脑损伤的分子药物靶点［13］。

miRNA调节缺血性神经损伤和促凋亡的相关机制 脑缺血引起神经细胞死亡有两种形式:凋亡和坏死。前者涉及一系列基因的激活和表达调控，大量的实验证实，miRNA在此过程中发挥重要作用。在小鼠MCAO和小鼠神经细胞瘤N2A细胞OGD模型中，miR-497被诱导表达，而阻滞miR-497作用后，OGD诱导的N2A细胞凋亡得到显著抑制。相反，有活性的miR-497能促进OGD诱导的神经元损伤和死亡。另有实验证明，bcl-2/-w的3'-UTR是miR-497直接靶点，miR-497能下调bcl-2增加线粒体膜的通透性。进一步研究揭示，敲掉miR-497能显著加强缺血区bcl-2/-w蛋白水平并减少缺血性脑梗死，改善神经系统功能［14］。以上实验说明，miR-497能通过负性调节抗凋亡蛋白bcl-2/-w促进脑缺血后神经元凋亡。

此外，在体外H2O2诱导PC12细胞凋亡模型中发现，与正常细胞相比，PC12凋亡细胞中检测到miR-160、 miR-61、 miR-122a、 miR-422a、 miR-494和miR-513共6个明显下调的miRNA分子，其中miR-422a和miR-122a调节的靶基因分别是bcl-w和N-myc［15］。N-myc 和 c-myc、mht-myc 是核蛋白原癌基因的Myc基因的组成部分，其中N-myc主要存在于中枢神经系统中。N-myc极少表达于正常神经细胞，其过度表达可诱发细胞凋亡。进一步研究发现，miR-422a与bcl-w蛋白表达负相关，同时，bcl-w被证实有miR-422a的作用位点，因此推测miR-122a和miR-422a可能分别通过调节N-myc和bcl-w蛋白表达参与了脑缺血神经细胞的凋亡调节［16］。let-7在海马的发育、分化和功能方面发挥重要作用，let-7最早是在秀丽隐杆线虫 (C.elegans)中发现的miRNA之一，具有高度保守性、时序性、组织细胞特异性，同时被证实是一种肿瘤抑制因子。脑缺血再灌注后24 h，let-7家族中的 let-7a/7b/7c/7d/7e/7f/miR-98表达均显著下调，通过调节与细胞死亡有关的因子表达，参与细胞凋亡调控，具体的机制还有待研究［17］。

miRNA参与缺血后神经再生调节 miRNA也参与了脑缺血后组织损伤修复——神经再生的调控。脑缺血后，补体C1q含量上调。补体C1q不仅能增强神经细胞的活力，促进突起生长和防止β-淀粉样蛋白诱导的神经元死亡，还通过下调特定miRNAs参与神经因子的表达调控。补体C1q可下调被预测能以神经生长因子 (nerve growth factor，NGF)和神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT-3)的mRNA为靶基因的let-7，使缺血后脑内NGF和NT-3表达增加，促进神经细胞的再生［18］。

miR-124和miR-134被证实均能调节局部树突棘的发育，其中前者通过调节反应结合蛋白，在神经系统中随着大脑成熟而表达增加［19］。研究发现，大鼠MACO后24 h两者均显著上调［20］，提示miR-124和miR-134可能参与调控缺血后神经细胞再生。深入研究发现，miR-290和在miR-124a与视锥蛋白样基因1(visinin-like 1，VSNL1)的抑制有关系，两者均通过抑制靶基因VSNL1调控神经再生［21］。

miR-137是原癌基因周期素依赖性激酶6(cyclin dependent kinase 6，CDK6)的直接抑制者，在星形细胞瘤中比在普通脑组织中表达减少，推测miR-137在星形细胞瘤的细胞增殖中发挥一定作用。同时miR-137只在暴露于OGD条件下的星形胶质细胞中增加［22］，提示脑缺血后miR-137可能通过抑制CDK6诱导星形胶质细胞增殖。另外，miR-26、miR-107和miR-210在缺氧环境下能降低凋亡前信号肽，被证实也与细胞增殖有关［23］。

miRNA与脑缺血损伤的诊断

缺血后miRNA特异性表达的时间效应，被认为是临床诊断脑损伤和预后的有效生物指标。例如，缺血性中风患者血液miR-210比健康对照组显著降低，尤其是在缺血性中风发作7 d和14 d时，另外，miR-210水平在预后较好的患者中显著提高，因此，推测miR-210可能成为临床诊断脑缺血及预后的一种新型生物标志物［24］。由于在体液中miRNA高度稳定存在，相对于传统影像学检测，体液检测miRNA具有灵敏度高、样本收集程序简便、一个样本可同时检测多项参数等优点，因而当前医学已尝试将miRNA用于缺血性脑损伤的诊断和预后的评判。

综上，脑内miRNA表达谱对临床治疗缺血性脑疾病具有极高的应用价值。近年来，随着对miRNA在脑内基因表达调控功能的不断认识，脑内miRNA表达研究受到广泛关注。目前，有关特异性miRNA在脑组织的生理功能以及脑损伤miRNA在不同脑区特异性调控机制的认识还有待深入。充分了解脑内miRNA表达谱，寻找特定miRNA作为临床脑缺血诊断和预后的鉴定指标，明确与miRNA相关的治疗靶点以及治疗药物，已成为当前退行性神经病变研究的重要方向和新内容。

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MicroRNA and Cerebral Ischemia

ZHANG Yu，GUO Jun

Laboratory Center for Basic Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

GUO Jun Tel:025-86862729，E-mail:Guoj69@yahoo.com.cn

MicroRNAs(miRNAs)are a class of highly conserved single-stranded RNA molecules that modulate gene translation.By targeting the mRNA of protein-coding genes，miRNAs play a critical role in neuronal differentiation，cell proliferation，apoptosis and metabolism.There are a lot of miRNAs in central nervous system，which are not only closely linked to development，differentiation and function of nerve cells，also play an important role in nerve lesions and dysfunction after cerebral ischemia.Specific miRNA through their own changes affect their target gene expression levels after focal cerebral ischemia，involving in the protection against apoptosis in neurons and regeneration after cerebral ischemia.A full understanding of the specific microRNA function and its underlying mechanism in the brain can provide a new strategy for the prevention，diagnosis，and treatment of ischemic cerebral injury at gene level.

cerebral ischemia;microRNA;functions

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):418-421基金项目:国家自然科学基金 (81170714)和江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81170714)and Jiangsu Province“Six Talents Peaks”Project

郭 军 电话:025-86862729，电子邮件:Guoj69@yahoo.com.cn

Q52

A

1000-503X(2012)04-0418-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.021

2011-10-11)

·论 著·