牙周膜干细胞在再生医学中的研究进展

郑 伟 刘朋飞 冯业童 董 超 周余来 (通化市口腔医院，吉林 通化 34000)

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)是来源于牙周膜的一类成体干细胞，具有较强的自我更新能力，并且可以进一步分化成为多种具有不同功能特性的细胞。目前研究表明，牙周组织疾病在中老年人中具有较高的发生率，PDLSC在维持牙周膜功能稳定、修复牙源组织损伤和实现功能性细胞更新等方面具有重要意义，该类成体干细胞是牙周组织再生最为直接可靠的一类种子细胞，也是牙周组织疾病细胞治疗和基因治疗模式最为重要的细胞学基础，在组织工程与再生医学中有着重要的应用前景〔1，2〕。

1 PDLSC的发现及相关分离鉴定

在2004年，Seo等〔3〕首次从人类牙周膜组织中分离出了一类具有一定分化潜能和较高自我更新能力的成体干细胞，即PDLSC。研究人员从25组人类第三磨牙中分离牙周膜，经过单克隆筛选和相关基因学、免疫学鉴定，获得了性质均一稳定的成体干细胞克隆株，将细胞移植到免疫缺陷的大鼠和小鼠体内，验证细胞的组织再生和对牙周病的修复功能，结果显示:PDLSC可向成牙骨质细胞、脂肪细胞、胶原形成细胞等方向分化，并且具有发育为牙骨质-牙周膜样结构的潜能，在牙周组织修复方面有重要的应用价值。

PDLSC有多种分离方式，分离鉴定技术也较为成熟。Liu等〔4〕采用牙周膜组织块贴壁培养的方式分离PDLSC，在组织块贴壁3～6 d后可见有细胞爬出，7～14 d后细胞密集生长，间充质干细胞表面标记CD146和STRO-1均呈阳性。Chang等〔5〕应用胶原酶消化法分离犬类的PDLSC，于37℃条件下，用浓度为0.25%的I型胶原酶对牙周膜进行消化，一段时间后即可获得单细胞，常规培养2 h后即可见贴壁细胞。该方法的细胞分离速度明显快于组织块贴壁法，但是酶消化时间不易控制，消化过度常会影响细胞活性。Shen等〔6〕结合上述两种方法，先将牙周膜组织修剪为1 mm3大小的组织块，再用I型胶原酶消化40 min后，进行组织块贴壁培养，一段时间后可见细胞爬出。该方法所获得的细胞自身活性较强，克隆形成效率较高，细胞在成脂、成骨分化方面具备一定的潜能。

2 PDLSC的分化潜能

PDLSC作为一种成体干细胞，具备多向分化的潜能，在Seo等〔3〕的实验中，研究人员将PDLSC移植到免疫缺陷鼠体内，细胞可进一步分化成为牙本质-牙周膜样结构，所以，PDLSC在牙源组织缺损修复等方面具有重要的应用前景。此外，PDLSC在成骨分化及神经分化等方面同样具备一定的分化潜能。

2.1 PDLSC的成骨分化 PDLSC的成骨分化研究较早，Sununliganon等〔7〕通过筛选获得了具有不同成骨能力的PDLSC克隆株，通过基因微阵列分析研究人员发现:PDLSC的成骨分化能力与细胞中细胞间黏附因子、整联蛋白β1及端粒末端转移酶密切相关，因此，可根据以上细胞分子的表达来进一步筛选具有高度成骨分化能力的克隆株。Kim等〔8〕以成年比格犬为研究对象，复制牙槽骨损伤模型，先将PDLSC用荧光进行标记后，再将该细胞与羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架材料相复合，植入损伤部位，经过8 w时间的修复，受损部位的组织有明显的改善，由此进一步证实PDLSC在牙源性组织再生和修复治疗方面的重要应用价值。

2.2 PDLSC的神经分化 多种成体干细胞均具有向神经方向分化的潜能，特别是在胚胎形成时期，与神经系统同属于外胚层的细胞更具优势。

Zhen等〔9〕对PDLSC先采用一定的方式进行预诱导，随后用β-巯基乙醇进行神经样细胞的定向诱导，诱导6 h后，进行相关蛋白及基因表达的检测。检测结果显示:经诱导的PDLSC表达神经微丝蛋白、神经胶质酸性蛋白以及神经元特异性烯醇酶，并且表达量远高于对照组;从形态学角度可见，经诱导后的PDLSC有一定的神经样细胞形态。

3 PDLSC的分化调节因素

PDLSC的分化受到多种因素的调节，许多物理因素、生化因素均会对细胞的分化模式、分化方向产生影响，合理调控分化因素，便于对细胞定向分化的掌控。

维生素是一种维持人体正常生理功能的一类微量有机物，在维持细胞活性，延长细胞寿命等方面有着重要作用。Wei等〔10〕研究表明，在维生素 C的刺激下，PDLSC的I型胶原、整联蛋白β1的表达量均增多，并且干细胞标记Oct4、Sox2、Nanog的表达上调，特别是成骨标记RUNX2、ALP和OCN的表达增加，与未经维生素C处理的PDLSC相比，这种类型的PDLSC在组织再生方面具有显著优势。Chadipiralla等〔11〕从人的乳牙牙周膜中分离PDLSC，在维甲酸的作用下连续培养3 w，结果显示:PDLSC在骨源性分化方面具有更大的潜能。

趋化因子是一类可吸引细胞向特异部位移行的小分子化合物，特别是在炎症反应中有着重要作用。Du等〔12〕通过趋化因子SDF-1刺激PDLSC后，发现PDLSC的增殖速率和细胞迁移速度明显加快，细胞自身活性也明显提高，I型胶原分泌水平增加，细胞在牙周组织分化方面具有更大的潜能。

Yang等〔13〕采用特殊的三维培养系统对PDLSC进行培养，进而从空间微环境角度改善细胞生长状态，进一步模拟体内的生理条件，打破常规培养方式的局限性。结果表明:三维培养模式的细胞骨唾液蛋白及成骨素基因表达均上调，碱性磷酸酶表达量增高，细胞矿化作用加速。将该细胞移植到免疫缺陷鼠体内，可分化为类似于牙本质-牙周膜样结构，可见，该方法培养的PDLSC在临床应用上更具前景。

4 PDLSC的重编程与再分化

2006 年，Takahashi等〔14〕将4 个转录因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)导入小鼠成纤维细胞中，获得了一种类似于胚胎干细胞状态、具有多向分化潜能的细胞，称为“诱导性多能干细胞”(induced pluripotent stem cells，iPS cells)。继此之后，Yu 等〔15〕和Takahashi等〔16〕分别成功地将普通的人体皮肤细胞转化为了具备人胚胎干细胞功能的iPS细胞，从而进一步推动了人源iPS细胞的研究发展。Kang等〔17〕首次利用iPS细胞，通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞的全能性。

一般认为，“重编程”是指成体细胞经过一定诱导方式，转变为iPS细胞的过程;iPS细胞经过进一步的定向诱导，再次分化为其他类型细胞的过程，称为“再分化”。通过重编程过程，可使成体细胞，甚至是终末分化细胞重新具有较高的分化能力，所以，iPS细胞的诱导技术已成为再生医学领域的研究热点。Wada等〔18〕通过逆转录病毒法将 Oct4，Sox2，cMyc和 Klf4四个转录因子转入PDLSC中，经过重编程后，获得了PDLSC来源的 iPS细胞，该细胞表达 SSEA4，OCT4，NANOG，GCTM-2，TG30和TRA-1-60等胚胎干细胞标记，在体外非定向分化的过程中，三胚层的代表基因均发生不同程度的变化，并且iPS细胞可在免疫缺陷鼠体内形成畸胎瘤，具备向三个胚层方向分化的潜能。Duan等〔19〕采用iPS与釉基质衍生物相复合的方法在体外诱导iPS定向分化，经过一段时间的诱导，iPS细胞中多种牙源组织相关基因均大量表达;组织学分析显示，iPS复合物具有一定向牙槽骨和牙周膜方向分化的趋势。

5 展望

随着再生医学的飞速发展，PDLSC作为一种新发现的成体干细胞已经逐渐引起人们的关注。诸多研究表明，PDLSC是牙周组织工程中的最有潜力的一类种子细胞，该细胞的高度自我更新能力和多向分化潜能使其在临床应用上具有广泛的前景〔20〕。但是，也应认识到，关于PDLSC的诸多研究内容尚处于基础研究阶段，在这一阶段中还有许多问题需要解决，例如:如何高效获得大量PDLSC、如何有效控制PDLSC的定向分化等。因此，只有完善PDLSC的一系列基础研究，建立安全可靠的临床应用模式，PDLSC才能真正为牙周疾病患者提供一条新的治疗途径。

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