高通量基因检测系统MammaPrint与乳腺癌预后预测

王波 综述 李洪胜 审校

广州医学院附属肿瘤医院乳腺肿瘤外科，广东 广州 510095

乳腺癌是高度异质性疾病，临床分期及病理分级相同的患者对治疗的反应和预后大不相同。如何准确预测患者复发风险及对治疗的反应，采取适当的治疗措施，从而避免治疗不足或治疗过度，是临床医师尤为关心的重要课题。随着现代分子生物学及基因组学研究不断深入，越来越多的研究结果证实：尽管乳腺癌是“一种”疾病，但实际上是许多细胞、组织功能异常的总和。与传统的TNM分期、临床病理指标相比，基因水平的多基因检测系统能提供更准确的预后预测信息，用于指导个体化治疗，合理利用有限医疗资源。在目前众多的多基因检测系统中，MammaPrint是首个经FDA批准用于临床的多基因检测系统。

1 MammaPrint 介绍

MammaPrint是2002年由荷兰癌症研究院开发的一种乳腺癌多基因检测系统［1］。其运用cDNA微阵列技术，检测78例临床Ⅰ期或Ⅱ期的乳腺癌患者(淋巴结阴性，年龄<55岁，肿瘤直径<5 cm)新鲜冰冻组织的RNA。所有患者至少随访5年，运用系统聚类统计方法，从25 000个候选基因中，筛选出与预后最相关的70个基因，组成MammaPrint检测系统。根据基因表达与临床结果的相关性，将患者分为预后良好组及预后不良组。预后良好组44例患者中位随访7.8年，无一例复发转移；预后不良组34例患者5年内均出现了复发转移。研究者将预后良好组作为参照，计算患者MammaPrint检测的基因表达谱与预后良好组的Pearson相关系数，相关系数>0.4为低危组，≤0.4为高危组，其误判率<10%。

2 有关MammaPrint 的回顾性临床研究

2.1 MammaPrint对淋巴结阴性患者预后预测

高通量基因检测系统MammaPrint建立后，不少研究者对其不断加以验证， Buyse等［2］对307例来自欧洲5个中心的腋窝淋巴结阴性患者进行独立样本的MammaPrint检测和临床病理指标分析，中位随访13.6年，终点事件为远处转移时间、无病生存和总生存。研究结果显示，MammaPrint对于各终点事件的预测要优于临床病理指标，其中对于远处转移时间和总生存的预测优势更明显，风险比(HR)分别为2.32和2.79。由于腋窝淋巴结状态是临床治疗及预后判断的重要指标之一，MammaPrint能较为准确判断腋窝淋巴结阴性患者的预后，因而再次验证了MammaPrint对于腋窝淋巴结阴性患者预后预测的准确性和其他临床病理指标所不具备的优越性。

2.2 MammaPrint对淋巴结阳性患者预后预测

腋窝淋巴结阳性的乳腺癌患者，传统的临床病理指标评价意味着预后不良，按照现时的临床治疗方案绝大多数会给予系统化疗。然而Joensuu等［3］发现，部分腋窝淋巴结阳性患者，单行合理的局部治疗也能长期无转移生存。那么，基于腋窝淋巴结阴性患者建立的MammaPrint检测系统可否较准确划分这两类患者，Mook等［4］对241例淋巴结1～3枚临床分期Ⅰ～Ⅲ期的可手术乳腺癌患者冰冻标本进行MammaPrint检测，99例(41%)患者被评为低危组，142例(59%)患者被评为高危组。结果显示：低危组和高危组的10年无转移生存率和乳腺癌特异性生存率分别为91%、96%和74%、74%。与Adjuvant！Online系统预测的结果比较显示：87%的患者被Adjuvant！Online系统预测为预后不良。而在这87%的患者中，MammaPrint系统评价其中的34%患者预后良好，其10年生存率为94%。这充分证明，用这一基因检测系统，可准确判断淋巴结阳性患者的预后，并避免对部分可长期无风险生存的患者实施过度治疗。

2.3 MammaPrint对新辅助化疗疗效预测

病理完全缓解率与患者生存期长短关系密切。Straver等［5］2009年在荷兰进行了一项旨在评价MammaPrint预测的低危及高危组与新辅助化疗病理完全缓解率相关性的研究。这一研究共纳入167例患者，接受MammaPrint检测后分为低危组23例(14%)，高危组144例(86%)。Her-2阴性患者化疗方案为：多柔比星+环磷酰胺或多西他赛及多西他赛+卡培他滨；Her-2阳性患者化疗方案为：紫杉醇+曲妥珠单抗+卡铂。结果显示低危组无病理完全缓解，高危组的病理完全缓解率为20%，总的病理完全缓解率为17%。对于化疗的敏感性，低危组为9%，高危组为37%(P=0.008)。这一研究提示，通过MammaPrint筛选出来的高危组有较高的化疗敏感性及病理完全缓解率，可积极实施新辅助化疗。

2.4 MammaPrint对辅助化疗疗效预测

虽然蒽环类、紫杉类化疗药的联合方案在乳腺癌术后辅助化疗中的疗效已被证实，但仍有约20%～30%的患者不能从中获益。Knauer等［6］进行的临床研究共纳入1 637例淋巴结阴性的乳腺癌患者，其中90%激素受体阳性。按照MammaPrint检测结果，将患者分为低危组及高危组，分析两组患者对辅助化疗的获益程度。共有226例患者接受了辅助化疗，绝大多数是基于蒽环类的联合化疗方案。研究的终点是乳腺癌BCSS和DDFS。中位随 访7.6年，低危组和高危组随访5年的BCSS及DDFS分别为97% vs 87%，95% vs 82%，低危组BCSS及DDFS明显优于高危组。这一研究结果显示，MammaPrint预测的低危组辅助化疗不能获益，而高危组辅助化疗获益显著。Albain等［7］进行的研究也得出相似的结果，提示MammaPrint对于淋巴结阴性、激素受体阳性患者辅助化疗疗效预测有相当高的准确性。

2.5 MammaPrint对不同雌、孕激素水平者的预后预测

雌、孕激素受体水平是乳腺癌患者的独立预后因素。雌、孕激素受体阳性者预后远优于阴性者。Bueno-de-Mesquita等［8］对701例乳腺癌患者激素受体水平分层后发现，淋巴结阴性激素受体阳性患者低危组、高危组的比例分别为55%(76/139)和45%(63/139)，这与临床观察到的雌、孕激素受体阳性者内分泌治疗40%～60%的有效率相吻合，提示MammaPrint对于激素受体阳性患者预后预测的价值是肯定的。同一组患者中，激素受体阴性患者低危组只有6%(10/156)，高危组的比例却高达94%(146/156)，这一研究提示Mammaprint对于激素受体阴性患者预后预测有相当大的局限性。

2.6 MammaPrint对绝经后患者的预后预测

MammaPrint最初设计是用于预测淋巴结阴性年轻患者的预后。然而多数乳腺癌是绝经后患者，身体状况总体比绝经前患者差，如何准确判断这部分患者的预后从而对化疗进行取舍更有实际意义。Wittner等［9］对100例中位年龄62.5岁绝经后淋巴结阴性患者进行MammaPrint检测，中位随访11.3年。MammaPrint低、高危组预测值分别为27%(27/100)和73%(73/100)。所有患者均接受了乳房切除术或保乳术及必要的腋窝淋巴结清扫术，根据病情，术后行放疗、化疗或内分泌治疗。随访10年，预测低危组的27例患者无一例出现复发转移；而高危组73例患者中只有9例发生复发转移。这一系统对于低危组10年远处转移的阴性预测值(真阴性值/预测阴性值)×100%，10年远处转移的阳性预测值(真阳性值/预测阳性值)为12%。这项针对绝经后患者的研究说明，MammaPrint系统能较准确地区分不需要化疗可长期生存的患者，从而避免过度治疗。

3 有关MammaPrint的前瞻性研究

3.1 RASTER实验

RASTER实验是Bueno-de-Mesquita等［10］于2004年—2007年进行的前瞻性临床研究，共纳入16家荷兰医院的585例患者，其中158例由于样品不符合要求而排除，最后入选427例并成功提取新鲜冰冻组织的RNA进行MammaPrint检测，低、高危组预测值分别为51%(219/427)和49%(208/427)，与 Mook等［4］的研究结果相仿。所有患者至少随访5年。研究者同时也进行了对比分析：Adjuvant! Online系统69%的患者被评为高危组；St Gallen系统高危组的比例达到83%；而MammaPrint预测的高危组只有49%。这一前瞻性的临床研究说明，MammaPrint检测系统可提供更精确的预后信息。这项实验证实了临床多中心大规模进行MammaPrint检测的可行性，为接下来的MINDACT实验奠定了坚实的基础。

3.2 MINDACT实验

由于RASTER实验旨在论证MammaPrint临床应用的可行性及对患者术后辅助化疗决策的影响，却不能评价MammaPrint预测低危组不使用辅助化疗对于患者生存的影响。于是Mook等[11]设计了MINDACT试验。这是一项多中心前瞻性随机对照临床实验，始于2007年，计划3年内入组6 000例淋巴结阴性的乳腺癌患者。所有患者均行MammaPrint与临床病理指标(本研究采用Adjuvant! Online)双重评价。如两者均评价患者预后良好(预计13%)，则不行化疗；如两者均评价患者预后不良(预计55%)，则行化疗；对于两者预后评价不一致的患者(预计32%)，将被随机分为两组：临床病理指标评价预后组，MammaPrint评价预后组，并按照各自的预后预测结果决定是否行辅助化疗。这一研究的核心分组是临床病理指标评价高危组而MammaPrint评价低危组被随机分配到MammaPrint组，对这一组患者长期随访的结果将最终明确MammaPrint与临床病指标的相关性。关于MINDACT临床试验众说纷纭［12-13］，针对这种基于高通量基因检测技术的临床实验所引起的道德、法律等问题现在尚没有定论。但这一研究对于MammaPrint检测系统由基础研究、临床验证到临床应用是最具说服力的，相信最终结果将对乳腺癌的治疗产生积极影响。

4 MammaPrint成效分析

Retèl等［14］从3个MammaPrint的回顾性研究中305例淋巴结阴性激素受体阳性乳腺癌患者，用构建的马尔科夫数学模型分析MammaPrint、St Gallen及Adjuvant！Online 3种预测模型用于指导患者治疗的成效比：成本项目包括患者检查、治疗及护理等总费用；以10年生存、质量调整生存及生活质量作为效益指标。结果发现3者在总生存方面没有明显差异，但在质量调整生存方面差异显著：用MammaPrint作预后预测并指导治疗组，质量调整生存率最高，同时成效比也是最优化。Tong等［15］针对MammaPrint和Adjuvant！Online的成效比研究得出类似的结论：MammaPrint使35%的患者重新分组，9%的患者避免化疗。与Adjuvant！Online相比，MammaPrint增加了0.13的寿命年和0.16的质量调整寿命年。

5 其他一些主要基因预后预测系统及与MammaPrint 的比较

5.1 乳腺癌分子分型

Perou等［16］利用cDNA微阵列技术分析65个手术切除乳腺癌标本，从8 102个基因中筛选出456个差异较大的基因，定义为“固有基因型”。研究者进一步分析这456个差异基因，将乳腺癌分为4个不同的亚型：Luminal型［雌激素和(或)孕激素受体阳性］；Her-2阳性型(激素受体阴性)；基底细胞型(Her-2及激素受体均阴性)及正常乳腺型。Luminal型又进一步分为Luminal A和Luminal B型［17］。Yu等［18］的研究首次证实了这5种分子分型同样适用于亚洲乳腺癌患者。Rouzier等［19］认为乳腺癌的分子分型不仅预示患者的预后不同，且对治疗的反应也不同，基底细胞型及Her-2阳性型预后最差，但这两组亚型对化疗的敏感性却最高。

5.2 21-gene(Oncotype DX)

Paik等［20］用RT-PCR方法检测福尔马林固定石蜡包埋组织的DNA，从250个候选基因中选出与患者预后最相关的21个基因，以此计算患者10年复发风险评分(RS)。低危组RS＜18，中危组18≥RS＜30，高危组RS≥30。多个临床验证证实了Oncotype DX对乳腺癌患者的预后预测优于临床病理指标［21］。

5.3 其他

除了分子分型、MammaPrint及Oncotype DX外，用于检测新鲜或冰冻组织mRNA的由60个雌激素阳性基因及16个雌激素阴性基因组成的76基因检测系统［22］，检测4%的甲醛溶液固定石蜡包埋组织的2基因检测系统(HOXB13：IL17BR)［23］，结合基因等级指数预测预后(GGI)的97基因［24］、188基因系统［25］及92基因系统［26］等都显示对患者预后预测有一定的价值。

众多的基因检测系统，到底哪种预测模型更好？Fan等［27］对295个样本进行检测，对比研究分子分型、MammaPrint、Oncotype DX及2基因(H:I)系统对于相同病例预后预测的一致性。研究者发现，除了2基因系统对预后预测无统计学意义外，对于同一个体大多数预测系统对患者预后预测结果相类似。基底细胞型、Her-2阳性型、激素受体阴性及Luminal B型的MammaPrint评价预后不良，Oncotype DX评价同样为高复发风险。进一步的研究发现，MammaPrint与Oncotype DX只有一个重叠基因SCUBE2，两者的检测方法、算法不同，但对大多数患者的预后预测结果是较一致的，全部试验组中，两者预测一致性的比例为81% 。研究者推测不同的基因检测系统预测预后相似度较高的原因，与不同个体、不同分组之间共同的生物学特点有关，有必要进行深入地研究，以提供更优化的预测模型。

6 MammaPrint与个体化治疗

目前临床常用NCCN(national comprehensive cancer network)指南或St.Gallen评估患者是否需要接受辅助化疗，但这两种系统都是基于传统的临床病理指标(患者年龄、肿瘤大小及分级、激素受体水平、腋窝淋巴结等)进行评估。Ebctcg［28］的研究指出，60%～70%的腋窝淋巴结阴性乳腺癌患者，单用局部治疗也能获得较好的10年总生存，只有30%～40%的患者会出现远处转移。使用临床病理指标进行评估使得这些患者中的大部分接受了不必要的辅助化疗。MammaPrint是基于基因水平的多基因检测系统，上述涉及的多个回顾性的临床验证已初步证实了其对患者预后预测明显优于临床病理指标，可较为准确地区分高危及低危患者，据此可给予相应的个体化治疗，最大限度避免过度治疗及治疗不足。

7 结语

MammaPrint是基于cDNA的高通量多基因检测技术，需要从新鲜冰冻组织提取RNA，而RNA又容易在体外降解。故其对标本的质量、转运、储存等有极高的要求，4%甲醛溶液固定石蜡包埋的标本无法行MammaPrint检测，这是其无法大规模进行临床验证、应用的最主要原因。较高的检测费用(约4 000美元/例)，也限制了其在大多数国家开展研究与临床应用。另外，多项回顾性的临床验证均显示MammaPrint对患者预后预测的优越性，并且前瞻性的临床研究(RASTER)已证实了临床实施的可行性，正在进行的大规模前瞻性的临床研究MINDACT实验会最终明确MammaPrint对于患者预后预测的准确性及相对于临床病理指标的优越性。相信随着预测模型的不断优化，更准确、简便、费用更适合的预测模型将对乳腺癌的个体化治疗发挥更大的指导作用。

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