布鲁氏菌的IV型分泌系统

布鲁氏菌为革兰氏染色阴性的胞内寄生菌，根据其生物学特性和侵袭宿主的倾向性可分为7个型：即马耳他布鲁氏菌（B.melitensis）、流产布鲁氏菌（B.abortus）、猪布鲁氏菌（B.suis）、绵羊布鲁氏菌（B.ovis）、犬布鲁氏菌（B.canis）、沙林鼠布鲁氏菌（B.neotomae）和水生哺乳动物布鲁氏菌（B.maris）［1］。布鲁氏菌感染动物主要表现为睾丸炎、不孕不育；人类主要表现为关节痛、波浪热、肝脾肿大、多汗、神经痛等症状［2］，给养殖业发展、人类健康和动物性食品安全带来很大威胁。

病原菌的致病力包括产生毒素（内、外毒素）的能力、侵入宿主机体的能力（粘附力和侵袭力等）以及在宿主体内的生存繁殖能力（包括细胞内和细胞外）。布鲁氏菌不能产生外毒素，没有质粒、鞭毛、菌毛，不形成芽孢，有毒力的菌株可带菲薄的荚膜。布鲁氏菌缺乏这些经典的致病因子，但是该菌却具有较强的侵袭力，并且在宿主细胞内的生存繁殖能力极强，因此布鲁氏菌的相关毒力因子的研究一直是布病病原学中重要问题之一。

随着现代分子生物学的发展，目前己知的布鲁氏菌毒力基因有：virB（IV型分泌系统）、控制脂多糖合成的基因、H2O2酶基因（抗氧化作用）、groE（高免疫性蛋白基因）、htrA（耐高温基因）、dnaK（压力蛋白基因）、SOD（超氧歧化酶基因）、rec（重组调节基因）、omp25、BvrR/Bvrs双组分调控蛋白基因等。

细菌的分泌系统能将部分蛋白转运到胞质外环境，这些被分泌的蛋白成为细菌获得营养的重要手段。对于致病性细菌而言，这些分泌性的蛋白帮助细菌发挥定殖、吸附等作用，还可以调理宿主细胞，逃逸宿主的免疫机制等［3］。根据革兰氏阴性细菌分泌蛋白途径的不同，可以将分泌系统分为6类：I—IV分泌系统、自转运分泌系统（autotransporter secretion）和两步转运分泌系统（two－partner secretion，TPS），有时又将后两个分泌系统统称为V型分秘系统。IV型分泌系统可以转运蛋白质和/或DNA和/或蛋白复合物［5－6］，该系统由11个不同的蛋白组成，跨越细胞膜建立一个转运的通道，通过一个类鞭毛样的结构与靶细胞接和，使分泌的蛋白到达靶细胞。转运的过程一步完成，在转运过程中需要ATP提供能量［7］。目前已在百日咳杆菌、幽门螺旋菌、军团杆菌中证实了该分泌系统的存在。

通过比较蛋白质组学方法研究发现，B.melitensis的virB可以影响胞内生存相关蛋白的表达［4］。

B.melitensis 16MΔvirB突变株在感染细胞时，丧失了在胞内生存、复制的能力，当与野生株共同感染细胞时，ΔvirB突变株获得了逃逸宿主细胞攻击的能力［10］。将B.abortus的virB 基因敲除后，使感染小鼠体内的免疫应答水平降低［19］。可见virB通过影响宿主细胞的一些基因的表达及改变信号通路，来调节布鲁氏菌在宿主细胞的生存，virB对于布鲁氏菌的胞内持续生存发挥着至关重要的作用，是布鲁氏菌的重要毒力基因。

1 布鲁氏菌IV型分泌系统（Type IV secretion system，TFSS）的发现

布鲁氏菌的TFSS最初是通过转座子TnblaM发现的，在B.suis的基因组中随机插入转座子使该菌失去了在Hela细胞和巨噬细胞生存和复制的能力。在其中的一个致弱株中，发现转座子所插入的该段基因与以农杆菌的virB9和virB10编码区、百日咳杆菌的ptlH和ptlG编码区有着较高的同源性。通过测序发现这段12kb大小的编码区与以农杆菌的11个virB蛋白区具有同源性。后来，随着B.abortus 2308基因组计划的完成发现了TFSS完整的启动子［8］。布鲁氏菌的TFSS是一个含有11个可跨越细菌膜的多蛋白复合物，由virB操纵子编码，与布鲁氏菌在宿主细胞内生存、复制有密切关系［9－10］。virB 在B.melitensis、B.abortus 和 B.ovis中持续表达［11］。

2 virB区的结构

virB 区有12个开放阅读框（ORF），virB1－11与以农杆菌的virB蛋白编码区同源。virB12由172个氨基酸组成，蛋白大小19kD，切除预测的信号肽序列后大小为17.5kD，含有脂蛋白序列（13～16位为LAAC残基），virB12与以农杆菌等的virB蛋白编码区没有同源性［12］。但virB12与rhizosphere（一种根际微生物）的两个质粒pSB102和pIPO2T有着高度的同源性［12］，并且virB12对于布鲁氏菌的致病力是必需的［8］。通过Northern blotting表明，virB区由同一启动子调控［8］。

3 virB区对布鲁氏菌毒力的影响

virB对于B.melitensis、B.abort us、B.suis在细胞内生存和繁殖是非常重要的［13－14］，缺失virB区基因的所有突变株都失去了在细胞内繁殖的能力［8，15］。统计了最近所有的毒力致弱突变株，发现大约有25%的毒力致弱株都是由于缺失了virB区基因，可见virB系统在布鲁氏菌的致病力上发挥着非常重要的作用。

细胞内寄生的病原菌入侵机体后，首先被吞噬细胞吞噬形成吞噬小体，然后溶酶小体与吞噬小体形成融合小体，以此来消化病原菌。布鲁氏菌在感染宿主后被宿主的吞噬细胞吞噬，形成布氏小体（Brucella－containing vacuole，BCV）［16］，在 TFSS的参与下，能有效地阻止溶酶小体与BCV融合，致使布鲁氏菌能在吞噬细胞中生存［17］。随后，通过依赖于TFSS的途径，BCV可持续的与网状内皮系统（Endoplasmic Reticulum，ER）相互作用，导致ER膜在BCV的积聚，使BCV获得ER的特性，从而逃逸宿主的免疫机制。而TFSS缺陷的布鲁氏菌不能调控BCV与ER发生相互作用，BCV处于中间、未成熟状态，最终与溶酶体融合，导致降解。据文献报道，TFSS主要在调控布鲁氏菌从BCV到ER的胞内运输过程中发挥作用，一旦布鲁氏菌到达其复制部位，该分泌系统即被关闭。不过，TFSS是如何调控布鲁氏菌的胞内运输的仍不清楚。

4 virB操纵子的调控

利用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因来检测virB操纵子在B.suis内的转录情况。GFP被插入到virB1基因上游。当布鲁氏菌在TSA或TSB培养基上过夜培养时，通过流式细胞仪检测发现没有细菌生长；当该菌感染J774巨噬细胞或Hela细胞时，经检测在感染后3h即可看到胞内细菌生长［8］。

将布鲁氏菌在不同条件下培养，提取菌体总RNA，以此来分析是什么因素影响virB操纵子转录的。研究发现，在成分丰富的培养基中，virB操纵子转录水平非常低；培养基成分比较贫瘠时，virB操纵子却处于较高的转录水平。研究还发现细菌处于不同的生长周期，virB转录的水平也不同。当细菌处于对数生长期早期时，virB的转录水平最高；当细菌处于复制的后期和静止期时，virB的转录水平比较低。碳源对于virB的转录水平影响也是非常重要的，在有葡萄糖、半乳糖和琥珀酸盐存在时，virB转录增强；布鲁氏菌在代谢过程中产生的其他碳源，像树胶醛糖、戊醛糖、赤藻糖醇存在时，对virB转录没有刺激作用。virB转录还受温度的影响，在37℃比在20℃的转录水平要高。Lin和Ficht（1995年）发现，布鲁氏菌处于pH4条件下3 h，该菌蛋白的合成水平显著降低，但virB操纵子转录水平显著提高。这些现象存在于B.suis和B.melitensis菌内。在B.abort us 2308菌株内virB操纵子的调控与B.suis和B.melitensis不同［18］，研究发现virB操纵子的转录发生在含有丰富培养基成分，发生在复制周期的衰退期。

Francoise Porte等人的研究表明，含有布鲁氏菌的吞噬小体在pH达到4h，即很快的酸化，这种酸化对于B.suis的繁殖是必需的。如果吞噬小体的酸化环境，在最初感染的几个小时内被氯化氨中和，或被药物抑制时，布鲁氏菌的复制也被阻断了［19］。当细胞在感染布鲁氏菌之前，用氯化氨等预处理后，发现感染后virB操纵子的转录停止。可见吞噬小体的酸化对于virB操纵子的转录是必需的［9］。

布鲁氏菌的基因组虽已被破译，但布鲁氏菌基因组编码的大多数蛋白的功能尚未确定，特别是分泌蛋白的研究。杨羽等人使用6种软件预测布鲁氏菌16M菌株的分泌蛋白［22］，得到具有信号肽的蛋白191个。但使用的软件、算法不同，可能得出的结果也会不同；并且利用生物信息学方法得出的结果可能会和试验的结果有一定的差异。还有利用蛋白质组学的方法从全基因组角度研究布鲁氏菌分泌蛋白的［23］，但有些分泌蛋白只有在侵入到宿主细胞时，发挥致病性时，才会分泌出来；而且由于细菌较易裂解，因而从细胞培养物上清中获得的分泌蛋白可能会存在着一些释放到其中的菌体蛋白，因而通过该方法得到的蛋白不能都确定为分泌蛋白。张沾等人通过对IV型分泌系统效应子VceC的研究表明VceC在侵染胚胎滋养层细胞过程中具有毒性作用［24］。王玉飞等人通过比较蛋白质组学的方法，发现virB操纵子通过影响相关蛋白的功能，包括VjbR，DnaK，HtrA，Omp25和GntR，来调节布鲁氏菌的胞内生存；并且T4SS影响外膜蛋白的特性，这可能与布鲁氏菌适应胞内、外的生存环境是紧密相关的［25－26］。

布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，在巨噬细胞中生存和繁殖是布鲁氏菌致病的关键环节，TFSS与布鲁氏菌的胞内生存密切相关，但是TFSS如何影响或调控该过程还不清楚。有关TFSS的研究主要集中在分析TFSS在布鲁氏菌胞内运输、生存和复制方面是如何发挥作用的［20－21］，这些机制的逐步阐明对于布鲁氏菌病的控制和净化将发挥重要作用。

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