小鼠海马内HDAC2的表达及其与NMDA受体、PSD-95的共定位

姚志刚，张 玲，刘 羽，黄 澜，马春梅，许艳峰，盛树力，秦 川

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

突触后致密区(postsynaptic density，PSD)是指在电镜下中枢神经系统内沿突触后膜胞质面分布的一种均匀而致密的带状或盘状结构。该结构厚约25～50nm，直径约250～500nm［1］。最近的研究发现，人脑中的PSD含有1461种蛋白，包括膜神经递质受体(NMDA受体、AMPA受体、mGlut受体等)、信号蛋白(CaMKII、SynGAP等)、支架蛋白(PSD-95、Homer、Shank等)、细胞骨架蛋白(tubulin等)、调节蛋白及修饰酶类(CaN、PKC、PKA等)等［2，3］。这些蛋白整合在一起形成的蛋白复合物有利于它们之间的相互作用和活性调节，使突触后信号快速并特异性地向胞质和胞核传递以影响蛋白质合成、突触可塑性调节和记忆形成。

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)能够介导组蛋白赖氨酸残基去乙酰化，导致带正电荷的赖氨酸残基与带负电荷的DNA分子之间的结合力增强、染色质发生固缩，使启动子不易接近转录调控元件，从而抑制基因转录［4］。目前已知HDACs包含四大类18个亚型，其中I类中的HDAC2对突触可塑性和学习记忆能力具有显著的负调控作用，但具体的分子机制尚未阐明［5］。而且，有关 HDAC2在海马部位的分布及其与PSD蛋白复合物是否存在相互作用的报道较少。本实验对C57BL/6小鼠海马内HDAC2的分布及其是否与多种PSD蛋白成员具有共表达关系进行形态学的观察和研究，以期为进一步探讨HDAC2与PSD蛋白复合物之间的内在联系及在海马相关的学习记忆过程中可能起到的调控作用提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3月龄健康雌性C57BL/6小鼠7只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，体重(20±2)g，合格证号为 SCXK(京)2009-0007。动物饲养于恒温(25℃)动物房独立通风系统(IVC-II型，苏州市苏杭科技器材有限公司)，光照14h，黑暗10h，自由饮水取食。小鼠脱臼处死后取全脑，入恒冷冰冻切片机(Leica CM l850，德国)行10μm连续冠状面切片，隔3片取1片。切片于4%多聚甲醛溶液固定20m in，再在0.01mol/L PBS中放置30min，最后经纯乙醇脱水2min，放入-20℃冰箱中保存备用。

1.2 实验试剂

小鼠抗小鼠 HDAC2多克隆抗体及兔抗小鼠NMDA受体亚单位 1(NR1)多克隆抗体均购自Abcam有限公司，兔抗小鼠PSD-95多克隆抗体由首都医科大学北京宣武医院多肽合成室提供。超敏型抗小鼠二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒、异硫氰荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG、罗丹明(TRITC)标记的山羊抗小鼠IgG、含有DAPI的水溶性封片剂均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色

HDAC2的组化染色按照试剂盒说明书步骤进行，HDAC2一抗稀释比例为1∶50。图像拍照及分析应用ProgRes CCD摄像头及分析软件。

1.4 免疫荧光双标染色

冰冻切片经20%山羊血清室温封闭20m in后直接滴加稀释好的两个一抗(不同种属来源)，HDAC2、NR1、PSD-95的稀释比例分别为1∶50、1∶100、1∶100，4℃过夜。次日0.01mol/L PBS洗涤后加入混合稀释的荧光标记二抗(稀释比例均为1∶100)，37℃水浴箱内孵育30min(注意避光)，0.01mol/L PBS充分洗涤后用含有DAPI(353nm波长激发产生蓝色荧光)的水溶性封片剂封片。阴性对照分别用正常兔和小鼠血清代替一抗，其余与上述步骤相同。样品利用激光共聚焦显微镜系统(Leica TCS-SP5)对免疫荧光染色切片进行分析和拍照，光源分别用488nm和550nm波长的激光器激发绿色和红色荧光，扫描分辨率为1024×1024pixel，计算机数据采集，数字成像。

2 结果

2.1 海马内HDAC2阳性神经元的分布

HDAC2免疫组化反应阳性细胞呈棕黄色，以胞核着色为主。在小鼠海马CA1～CA3区锥体细胞层和齿状回颗粒细胞层的神经元胞核内，HDAC2均有较高的表达量；在海马始层、辐射层、腔隙-分子层、分子层和多形层散在分布着少量的HDAC2阳性细胞；而在海马槽和海马伞部位罕有HDAC2阳性着色细胞。

2.2 NR1、PSD-95阳性神经元在海马内的分布

由FITC绿色荧光基团标记的NR1以胞膜着色为主，胞质淡染。阳性染色神经元主要集中在海马CA1～CA3区锥体细胞及齿状回(DG)颗粒细胞中，始层、辐射层、腔隙-分子层和多形层可见少量散在分布的阳性神经元(图1)。PSD-95为胞质蛋白，FITC绿色荧光基团标记的阳性神经元主要分布于各区锥体细胞层和齿状回颗粒细胞层，此外始层、辐射层、腔隙-分子层和多形层亦有散在表达(图2)。但在海马室床和海马伞细胞中均少见有NR1、PSD-95阳性染色细胞分布(图1，2见彩插1)。

2.3 HDAC2与NR1、PSD-95的共表达

拍照后的图像叠加处理发现，如图1和2所示，NR1、PSD-95染色阳性(绿色)的海马CA1～CA3区锥体细胞层和齿状回颗粒细胞层的神经元胞核均有HDAC2的表达(红色)，且在CA1～CA3区始层、辐射层和腔隙-分子层亦可见少量散在分布的双染神经元。此外，DAPI复染细胞核形成的蓝色区域与红色区域的重叠证实HDAC2主要表达于核内。

3 讨论

海马属于边缘系统，是人类和其他哺乳动物大脑的重要组成部分。大量的实验资料和临床观察表明，海马结构与空间和识别记忆密切相关［6］。C57BL/6小鼠常被认作是“标准”的近交系小鼠，可为许多基因工程动物提供遗传背景。最近的研究显示，C57BL/6小鼠海马在3月龄后基本发育成熟［7］。因此，本实验选取3月龄C57BL/6小鼠海马作为研究NMDA受体、PSD-95、HDAC2表达及共定位的结构基础。NMDA受体属于亲离子型谷氨酸受体，属于突触后致密区的组成成分之一。NMDA受体与谷氨酸结合，迫使NMDA受体离子孔道中的镁离子斥出而打开NMDA受体孔道，Na+与Ca2+内流使突触后神经元内Ca2+浓度升高，激活多种Ca2+依赖的信号转导途径，如 Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(CaMKII)，后者激活细胞核内转录因子诱导基因表达和突触可塑性的改变。突触可塑性能够诱导新神经回路的建立，因此被认为是学习记忆的基本神经机制［8］。PSD-95是位于突触后致密区的一种支架蛋白，属于膜相关的鸟苷酸激酶家族。PSD-95能够形成多聚体与NMDA受体亚单位相结合并锚定于突触后的特定部位，并通过与NMDA受体信号通路中一系列相关蛋白结合将信号分子、调节分子和靶蛋白有机地整合于谷氨酸能突触结构并形成信号复合体，影响突触结构和功能可塑性［9］。研究表明，在海马依赖的空间记忆形成过程中，NMDA受体亚单位NR1，NR2A和PSD-95可被招募至突触膜表面，以增强突触可塑性过程中突触传递的效能［10］。并且PSD-95还有助于NMDA受体的簇集和锚定［11］。本实验研究发现NMDA受体亚单位NR1和 PSD-95在7只成年小鼠海马 CA1～CA3区锥体神经元和齿状回颗粒神经元内均有广泛分布，这与已有的报道相一致［12，13］，表明 PSD蛋白复合物在海马依赖的学习和记忆过程中起着重要的作用。

近年来，染色质重塑对学习记忆的调控作用越来越成为研究的热点［14］。本研究发现，HDAC2在7只小鼠海马CA1～CA3区锥体细胞和齿状回颗粒细胞核内均有丰富表达，且与NR1、PSD-95存在明显共定位现象。Guan等［5］发现脑内 HDAC2过表达时，小鼠海马神经元树突棘密度降低、突触形成减少、CA1区LTP形成障碍、空间记忆和工作记忆障碍。而HDAC2敲除或给予了HDACs抑制剂的小鼠则表现出了与上述相反的改变。这提示HDAC2对突触可塑性和学习记忆具有负调控作用。最近的研究证实，正常小鼠经学习记忆行为训练后海马神经元内PSD-95、CaMKIIα、CREB等突触可塑性相关基因启动子区存在组蛋白H3和/或H4的乙酰化修饰现象［15，16］。因此，推测在 HDAC2过表达的小鼠模型中，这些突触可塑性相关基因启动子区组蛋白H3和/或H4的乙酰化水平下降引起相应蛋白表达减少并导致突触可塑性障碍。相反，在 HDAC2敲除或给予HDACs抑制剂的小鼠脑中，升高的组蛋白乙酰化水平使PSD-95、CaMKIIα等突触可塑性相关基因表达增加，最终促进突触结构和功能的可塑性。而在野生型小鼠的学习记忆过程中，PSD蛋白活化介导的信号转导途径可能参与了对HDAC2活性的调节。如甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)可结合于基因启动子区并募集REST、CoREST和HDAC2等形成复合物抑制基因的转录。由NMDA受体激活的信号通路可活化CaMKII，后者又可进入胞核诱导MeCP2磷酸化，导致转录抑制复合物不稳定性增加而解离，从而促发基因转录［17］。最近的研究发现，C57BL/6小鼠在16月龄时海马组蛋白 H3和H4乙酰化水平显著降低并且情景恐惧记忆存在缺陷，推测其HDACs(包括HDAC2)的表达和/或活性可能有所增高［18］。

目前有关HDAC2对学习记忆的调控机制尚有诸多问题需要深入研究，例如，HDAC2参与调控哪些突触可塑性相关基因的表达以及HDAC2的上游信号转导通路的识别。结合已有的文献资料和我们的实验结果，从形态学角度推测在学习和记忆过程中，PSD蛋白成员可能通过信号转导影响核内HDAC2转录抑制复合物的装配而促进突触可塑性相关基因的表达，并且这一机制可能又反过来影响PSD蛋白成员的表达水平，最终导致突触结构和功能的变化以调节学习记忆过程。本研究为探讨染色质修饰在学习记忆中的调节作用提供了细胞学基础，并为以C57BL/6小鼠为遗传背景、具有认知障碍表现的转基因动物的研究提供了形态学线索。

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