蜜蜂级型分化的研究进展

王亚男 冯成强

（1.中药资源保护与利用北京市重点实验室，北京 100875；2.北京师范大学资源学院 资源生态与中药资源研究所，北京 100875）

蜂王和工蜂都是由受精卵发育而来的，它们的遗传物质完全相同，仅由于发育环境和营养条件的不同，它们在形态和生殖能力等多方面存在着显著的差异。究竟是何种物质对蜜蜂级型分化起关键作用，研究人员做了大量的研究，但至今为止尚未完全确定；此外，DNA甲基化作为常见的表观遗传学现象之一，近些年来被应用于蜜蜂级型分化机制的研究已经取得了突破性的进展。鉴于此，本文结合相关研究背景和文献，对蜂王浆中决定蜜蜂级型分化的活性因子和DNA甲基化对蜜蜂级型分化影响的相关研究进展做一综述。

1 蜜蜂的级型分化

级型分化是指在社会性昆虫群体中，相同性别的个体具有不同形态结构、职能和行为的现象。

对于蜜蜂而言，通常是由两种性别三种类型的蜜蜂个体组成，即蜂王、工蜂和雄蜂，这三种类型的蜜蜂在养蜂学中统称为“三型蜂”。其中，这两种性别的蜜蜂即为雌性蜜蜂和雄性蜜蜂。在雌性蜜蜂中又分化出两种级型，即蜂王与工蜂[1，2]。蜂王与工蜂都是由受精卵发育而来，终身食用蜂王浆可使孵化后的幼虫发育成蜂王，而只在孵化后仅前三天食用蜂王浆的幼虫最终发育为工蜂。蜂王与工蜂不仅在外形上差异显著，而且蜂王的寿命是工蜂的10倍以上，且在产卵高峰期，蜂王每日能产下2000粒卵，其总卵重几乎与蜂王体重相近。

2 影响蜜蜂级型分化的主要活性物质

在蜜蜂群体中，蜂王和工蜂间不同的分化是由于蜜蜂幼虫得到的食物不同而引发的，显然，蜂王浆在其中起着关键作用。始终用蜂王浆喂养的新孵出的幼虫注定发育成蜂王，蜂王浆导致代谢加速和全身发育的增强，并调控基因在表达水平上产生变化，从而控制发育的进程。然而，鲜蜂王浆的成分非常复杂，含有水分60%～70%，蛋白质12%～15%，脂类3%～6%，糖类10%～16%，10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA，王浆酸）1.4～2.0%，维生素、游离氨基酸、矿物质、生物酶以及酚类化合物等[3]，其中蛋白质、糖类是蜂王浆中的主要成分。蜂王浆蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组成，水溶性蛋白占总蛋白含量的46%～89%，为王浆蛋白的主要部分，称为主要王浆蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）[4]。MRJPs家族至今已经鉴定出九个成员：MRJPs 1-9[5-7]，其中MRJP1-MRLP5约占蜂王浆总蛋白的82%～90%，含量最高的MRJP1占水溶性蛋白的48%[8]。MRJP1是一个分子量为350-420kDa弱酸性糖蛋白寡聚体[9-11]，MRJP2，MRJP3，MRJP4和MRJP5分别为49kDa，60-70kDa，60kDa和80kDa的糖蛋白[12]。

在蜜蜂幼虫发育的初始阶段，尤其是在蜜蜂关键日龄L3（3日龄），是蜂王浆中的何种物质通过激活何种途径从而决定了蜜蜂的级型分化，近些年来逐渐成为蜜蜂表观遗传学研究者们的研究热点。

2.110-HDA是蜜蜂级型分化的主要活性物质

Bedford MT等发现，蜜蜂的级型分化可部分地归因于蜂王浆中含有10-HDA，具有组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACi）活性。首先，他们利用K-rastransformed NIH 3T3细胞报告系统检测，发现5mMd 10HDA溶液的确具有表观遗传调控活性。然后，他们在第二个表观遗传报告系统——GF2-4细胞报告系统中检测了10-HDA的活性，发现10-HDA本身不具有DNA脱甲基的功能，但是参与一个抑制基因转录的途径，这一途径与DNA甲基化途径平行。最后，他们又在第三个模型系统——SW48细胞（一个人类克隆癌细胞系）报告系统中进行了研究，结果得到了和第二个系统相同的结果，即10-HDA不能独自激活沉默的GFP位点，但可明显加强5-Aza激活GFP的能力，并且在此细胞系，蜂王浆和10-HDA都能重激活表观遗传沉默的p21的表达。后来，他们利用体外实验和K-ras-transformed NIH 3T3细胞报告系统发现10-HDA和蜂王浆一样抑制了HDAC活性或推动了组蛋白乙酰转移酶活性[13]。

2.2 蜂王浆主蛋白1（MRJP1）是蜂王浆中决定蜜蜂级型分化的关键因子

蜂王浆蛋白在干物质中占有较大的比重，因此，蜂王浆中的MRJPs被认为是从幼虫到蜂王的发育过程及蜂王发挥特殊生理功能的关键因素。尤其是MRJP1（57kDa蛋白）具有一系列的生物学活性，国内外对其的生物学功能做了大量的研究。Kamakura等发现MRJP1能显著地促进肝细胞DNA的合成，可能具有保护肝脏的作用；另外，它还能增加白蛋白的合成，促进细胞增殖，可能起到细胞分裂素的作用[14]；Majtan等发现MRJP1能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子（TNF-a）[15]；Kamakumra等报道的抗疲劳作用可能与MRJP1有关[16]。

鉴于MRJP1的多种生物学功能，研究人员对MRJP1对蜜蜂级型分化的影响做了相关研究。镰仓昌树发现蜂王浆中的MRJP1（57kDa蛋白，也称Royalactin）使蜜蜂幼虫变成蜂王。新鲜蜂王浆中的MRJP1在40℃下贮存30天将完全降解，并且此时的蜂王浆喂养蜜蜂幼虫，蜜蜂将发育为工蜂；反之，40℃下贮存30天的蜂王浆中加入MRJP1，然后喂养蜜蜂幼虫，发现蜜蜂的发育时间缩短，新羽化的蜜蜂成虫的体重和卵巢体积增加，并且加入的MRJP1越多，这种趋势越明显，当MRJP1的质量浓度达到2%时能与新鲜蜂王浆一样使4日龄的蜜蜂幼虫最终发育成蜂王。这些结果显示，MRJP1是蜂王浆中诱导蜜蜂发生级型分化的主要功能因子。而且，MRJP1在果蝇（Drosophila melanogaster）上有类似的效果。后来镰仓昌树又对MRJP1对蜜蜂级型分化的作用机理做了一系列的研究，发现MRJP1能激活一种叫做p70 S6激酶，这个激酶对幼虫体型的变大有重要的作用，它能够增加细胞分裂素活化蛋白激酶的活性（该酶在缩短虫体发育时间中起重要作用），提高卵巢管发育必需的保幼激素水平。并且发现，敲除蜜蜂和果蝇脂肪体中的表皮生长因子受体（Egfr），能阻碍royalactin诱导的所有形态变化。这些研究表明，royalactin是蜂王浆中的一个通过Egfr-调节信号通道来诱导幼虫发育成为蜂王的特殊因子[17]。

2.3 其它物质对蜜蜂级型分化产生影响

此外，蜂王浆内含有苯丁酸[18]，现已知是组蛋白去乙酰化酶抑制剂和植物生长调节剂，并且发现其能改善小鼠的认知缺陷[19]和延长果蝇的寿命[20]。虽然苯丁酸对蜜蜂级型分化的影响尚未研究，但是为研究营养因素对蜜蜂级型分化的影响提供了物质参考。

无论是蛋白质、糖类或是蜂王浆中的其它物质促使蜂王幼虫进食更多的食物，都是通过在肠道内的牵张感受器，发送信号给大脑[21]。通过咽喉侧腺合成的较高的保幼激素能降低细胞凋亡并调控蜂王特定基因的表达，从而分化成蜂王[22]。蜂王和工蜂的幼虫有不同的被激活基因[23]，同样还有不同的蛋白质图谱[24]。具体是何基因被激活，通过怎样的调控网络影响蜜蜂的级型分化至今为止尚不清楚。因此，进一步研究蜜蜂级型分化的分子机制，探究蜜蜂级型分化过程中基因调控的变化，对蜜蜂科学领域的研究具有重要意义。

3 蜜蜂级型分化机制的研究

雌性蜜蜂的级型分化是一种典型的表观遗传学现象，基因序列没有发生改变，但基因功能发生可逆的、可遗传的改变，并最终导致了表型的改变，不符合传统的三大遗传定律（即基因分离定律、基因重组定律、基因连锁互换定律），是一种全新的遗传机制。常见的表观遗传学现象包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重组、遗传印记、X染色体失活、RNA调控、位置效应斑、等位反式互补等。DNA甲基化作为常见的表观遗传学现象之一，最近几年应用于蜜蜂级型分化的研究并取得了突破性进展。

3.1 DNA甲基化

DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，它能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。在真核生物中，这种修饰是指在DNA甲基转移酶的作用下，甲基基团转移并共价结合到DNA模板序列中的胞嘧啶C位置上。而且，绝大多数都发生在CpG二核苷酸位置。DNA的不同甲基化状态（甲基化与去甲基化）与基因的活性和功能有关。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达[25]。

DNA甲基化普遍存在于细菌、植物、真菌和动物的基因组中[26，27]。在动物模型系统中，已经对DNA甲基化进行了广泛的研究，然而在其他物种，尤其是非脊椎动物中，研究较少。脊椎动物和非脊椎动物之间，基因组DNA甲基化的模式差异极大，所以，DNA甲基化在不同物种中的功能也可能有显著差异[28]。

蜜蜂的全基因组测序工作在2006年已完成，这为以后的蜜蜂基因组功能的研究和开发奠定了基础。并且蜜蜂是第一个已知的具有全部DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶（Dnmts）的昆虫，这些甲基转移酶包括Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3，通过序列同源比较发现蜜蜂DNA甲基转移酶基因功能区序列与哺乳动物（特别是人）的DNA甲基转移酶具有很高的保守性，这为以后蜜蜂基因组甲基化的研究奠定了基础[29]。

3.2 DNA甲基化对蜜蜂级型分化影响的相关机制

在哺乳动物上的研究表明环境因素（比如饮食）也可改变基因后来的表达状况，并且通过DNA甲基化和组蛋白乙酰化等模式影响基因表达[30]。

Kucharski R等首次将DNA甲基化的表观遗传学理念应用于蜜蜂级型分化的研究，发现沉默DNA甲基化酶3（后生全体编码改变的关键因子），导致刚孵化的幼虫像始终被喂食蜂王浆的幼虫一样改变了发育轨迹，最终发育成蜂王，并且发现蜜蜂关键日龄L3（3日龄）后期幼虫体内基因组CpG甲基化水平决定了其级型的分化。他们通过运用RNA干扰技术处理新孵化出的幼虫，使Dnmt3沉默。在Dnmt3、siRNA处理过的幼虫中，72%的长大后发育成蜂王（拥有发达的卵巢），剩下的28%发育成工蜂（拥有基础的卵巢）。通过检测蜜蜂中所有基因的CpG甲基化程度，发现dynactin p62是至今为止在编码外显子的序列中唯一被甲基化的。有48%的蜂王幼虫相比于58%的工蜂幼虫dynactin p62甲基化的量减少，暗示某一基因的甲基化状态与蜜蜂幼虫的发育轨迹一一对应。他们的研究结果最终表明蜜蜂DNA甲基化用来储存遗传信息，摄入的营养有区别的改变这些信息，从而影响后期的发育命运，引起生殖状态和行为等的巨大变化[31]。

Elango N等研究了蜜蜂全基因组水平DNA甲基化情况。他们发现蜜蜂体内发生DNA甲基化基因与果蝇、蚊子、蕨类植物存在着明显差异，可分为两类：一类是CpG二核苷酸含量很高，即high-CpG基因，在工蜂中多上调表达，参与生物体的个体发育； 另一类是CpG二核苷酸含量很低，即low-CpG基因，在蜂王中多上调表达，参与基础代谢和核酸加工[32]。

Frank L等研究发现，通过DNA甲基转移酶3的沉默活动，后生机制的一个关键组成部分控制全部基因编码，能够产生具有蜂王特点的成年蜜蜂。DNA甲基化系统的相对简单的变动不仅模仿蜂王浆作为饮食对表型的影响而且改变插入基因的胞嘧啶甲基化模式。此外，对蜂王和工蜂的基因表达分析表明它们的可选择性发育途径是在一个基因编码保守的生理代谢蛋白质的特殊群体中与微妙的转录变化相关。他们运用测序技术从单碱基分辨率上确定在蜂王与工蜂的大脑中甲基化胞嘧啶的分布。研究发现，几乎所有发生甲基化胞嘧啶都位于5854基因外显子的CpG二核苷酸，表现出比非甲基化基因更大的序列保守性。超过550个基因表明存在于蜂王和工蜂间的显著的甲基化差异，揭示了甲基化模式的复杂动态。差异甲基化基因的独特性是通过中间的CpG密度来强调的，涉及CpG密度降低的基因甲基化和CpG密度升高的基因非甲基化。并且发现甲基化模式和剪接位点间存在很强的联系，包括那些可能产生替代的外显子。在甲基化和剪接之间的联系由来自所属的组蛋白基因家族的不同基因甲基化来进一步验证。由此猜想，选择性剪接的调控是在蜜蜂中基因甲基化和基因调控相联系的一种机制[33]。并且研究确认，与大量的甲基化哺乳动物的基因组相比，具体蜜蜂基因组只有特殊的一小部分甲基化。此外，出现在一组基因里的甲基化胞嘧啶比非甲基化基因显示更高水平的保护作用。在蜂王和工蜂的大脑中近600种此类基因表现出显著的甲基化差异，这表明其转录可能是在与后续相关的方式进行基因组的变化。在所有三种个体（蜂王、工蜂、雄蜂）对选定基因进行深入序列分析，结果表明每一种个体的大脑甲基化模式都是不同的[33]。

石元元等发现营养和空间因素通过DNA甲基化影响蜜蜂的级型分化。在营养条件一致的条件下，随着发育空间的增大，蜜蜂幼虫的头部Dnmt3酶活性、Dnmt3 mRNA相对表达量、dynactin p62基因甲基化水平都显著降低，幼虫发育成工蜂的比例降低，更趋向于向蜂王方向发育；在空间条件一致的条件下，随着蜂王浆采食量的增加，蜜蜂幼虫的头部Dnmt3酶活性、Dnmt3 mRNA相对表达量、dynactin p62基因甲基化水平都显著降低，幼虫发育成蜂王的的比例显著提高，更趋向于向蜂王方向发育[34]。并且，石元元等为了研究人工注射Dnmt3 siRNA对意大利蜜蜂雌蜂的Dnmt3酶活性、Dnmt3 mRNA表达量、dynactin p62基因甲基化水平以及蜜蜂形态指标之间的影响和关系，分别给3组3日龄的意大利蜜蜂幼虫人工注射50ng Ringer，uth siRNA和Dnmt3 siRNA溶液，在幼虫的发育过程中，测定每组幼虫头部的Dnmt3酶活性、Dnmt3 mRNA表达量、dynactin p62基因甲基化水平以及刚羽化雌性蜜蜂的初生重、体长、前翅长、前翅宽、吻长、第3 背板长等形态指标。经研究发现，人工注射Dnmt3 siRNA不仅可以显著降低意大利蜜蜂幼虫头部Dnmt3酶活性、Dnmt3 mRNA表达量和dynactin p62基因整体甲基化水平，同时显著提高了刚羽化雌性蜜蜂的初生重、体长、第3背板长。这些结果说明Dnmt3的改变可以影响雌性意蜂幼虫的发育[35]。

刘亭亭等为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana 的DNA甲基化模式，将中华蜜蜂与其他物种的Dnmt3基因的结构域进行比对，同时将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的Dnmt3氨基酸序列进行同源性比对和系统发育分析，发现中华蜜蜂与西方蜜蜂的Dnmt3序列一致性高达99%。并且发现该基因在工蜂和蜂王不同发育时期均有表达，但蜂王蛹中的表达量显著高于工蜂蛹（P＜0.05）；1日龄的蜂王中的表达量显著高于1日龄的工蜂（P＜0.05）；产卵工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异（P＞0.05），说明在发育和生命活动过程中，中华蜜蜂体内存在完整的DNA甲基化系统[36]。这些结果推测中华蜜蜂可能与西方蜜蜂一样，Dnmt3的改变可以影响雌性中华蜜蜂幼虫的发育。

4 总结与展望

蜂王和工蜂的遗传物质相同，然而由于后期环境和营养条件等不同，形态和生殖能力等多方面产生巨大差异，因此蜜蜂对于表观遗传学研究具有很高的模型价值。对于影响蜜蜂级型分化的主要活性物质，研究人员做了大量的工作，迄今为止主要认为是10-HAD或者MRJP1在蜜蜂级型分化起关键作用。DNA甲基化作为常见表观遗传学现象之一，对蜜蜂的级型分化起决定作用，尤其是蜜蜂脑内的DNA甲基化水平。

然而MRJP1易发生降解，不易保存，影响今后对MRJP1的活性开发，并且MRJP1进食入蜜蜂虫体内将酶解成多种多肽，蜂王浆多肽相对于蜂王浆蛋白更易保存，并且具有多种生物活性，更符合蜂王浆在幼虫体内发挥作用时的形态，因此进一步研究蜂王浆多肽对蜜蜂级型分化的作用具有重要意义，从而将蜂王浆的神奇生物学功能应用到更广泛的领域中；随着对DNA甲基化研究的更加深入，期望找到更具有代表性的甲基化基因，作为检测蜜蜂发生级型分化的重要靶标；对于蜜蜂级型分化的研究，除DNA甲基化作为调控机制研究之外，还可深入对组蛋白修饰、RNA调控等多种表观遗传学现象的研究，从而丰富蜜蜂级型分化的调控网络。

当然，蜜蜂的级型分化调控网络十分复杂，根据现在的研究结果很难建立完善的物质调控机制。对于蜜蜂级型分化的研究还有相当多的工作要做，随着新生物技术的发展和新领域的开拓，逐渐丰富影响蜜蜂级型分化的活性物质和相关机制的研究，从而也为哺乳动物的表观遗传学研究提供更多理论基础。

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