西洋参组织培养研究进展

2012-01-24刘辉高文远左北梅董艳艳王娟

中国现代中药 2012年3期

刘辉，高文远，左北梅，董艳艳，王娟

（1.天津科技大学，天津 300457；2.天津大学药物科学与技术学院，天津 300072；3.天津中医药大学，天津 300193）

西洋参PanaxquinquefoliumL.，又称美国人参（American ginseng），原产于美国东部和加拿大，是五加科（Araliaceae）人参属植物。具有补气养阴，清热生津的功能。西洋参的栽培周期较长，一般要4年时间，通过组织培养来生产西洋参的活性成分，可以节约土地，缩短培养时间，是西洋参资源解决的一条替代途径[1-2]。本文综述了西洋参组织培养的研究进展，为西洋参资源的研究提供参考。

1 西洋参愈伤组织的诱导

用于诱导西洋参愈伤组织的外植体，可以是不同参龄的根、根髓、茎段、叶片、叶柄、花药、花蕾、胚及胚培养幼苗的子叶和胚轴等[3]，其中芽胞、种胚、叶柄和根都是较理想的外植体。愈伤组织的诱导率在68.7%～97.7%，最高可达100%[4]。除了外植体的取材部位，外植体的取材时期也会影响愈伤组织的诱导，5月下旬至6月上旬所取的外植体的愈伤组织诱导率可达95%以上，而6月下旬以后所取的外植体的愈伤组织的诱导率仅30%左右，而且愈伤组织生长缓慢[5]。西洋参芽胞的脱分化先从表面发生，以后逐渐向内生长，张美萍等[4]以西洋参根为外植体的实验表明外植体的脱分化是发生在导管和筛管部位，由内部向外隆起，膨大，最后胀破外皮褥出愈伤组织。

用于西洋参愈伤组织诱导和继代培养的基本培养基有MS，NB，B5等几种，其中MS培养基诱导率最高，达到75.51%。研究发现，西洋参愈伤组织在MS培养基中生长较快，鲜重和干重都较大；在B5培养基中生长较慢，但有利于愈伤组织中人参皂苷的积累。培养基中成分的改变会对细胞生长和皂苷合成产生显著的影响[6]。将 MS基本基质中KNO3、CaCl2和MgS04的浓度分别降低至原来浓度的1／8、1／6和1／4对西洋参培养物的生长有促进作用，降低KNO3和CaCl2的浓度不利于皂苷合成，但适当降低 MgS04的浓度利于皂苷合成。浓度为0.65 mmol·L-1的磷最有利于西洋参细胞的生长，而1.25 mmol·L-1的磷为皂苷和多糖合成的最适浓度[7]。范代娣等[8]将 MS培养基中 MgSO4·7H2O含量由370 mg·L-1降低到 92.5 mg·L-1，可使嫩茎愈伤组织诱导率提高到100%，愈伤组织生长速度提高1.33倍。

西洋参愈伤组织的诱导须添加生长素类物质，与细胞分裂素合用可起到促进作用。常用的生长素有 NAA（α-萘乙酸）、IBA（3-吲哚丁酸）、IAA（3-吲哚乙酸）和2，4-D（二氯苯氧乙酸）单独使用均可诱导外植体产生愈伤组织，但IBA、NAA和IAA单独使用时，诱导率都不高，而且脱分化时间较迟。以2，4-D（2～3 mg·L-1）和6-BA0.5 mg·L-1诱导率最高，达到75.51%～100%。在诱导愈伤组织时，2，4-D起主导作用，附加IBA对愈伤组织产生无明显促进作用[6-9]。在 MS培养基中同时加入2，4-D（2.5 mg·L-1）、KT（0.8 mg·L-1）及 LH（700mg·L-1），对愈伤组织生长同样具有促进作用[10]。

2 西洋参细胞悬浮培养

由于愈伤组织在固体培养基上增殖较慢，不适于进行大规模生产，而西洋参细胞悬浮培养比愈伤组织固体培养生长速度提高近80%。

西洋参细胞悬浮培养必须在有激素的培养液中进行。常使用的培养基主要是MS及其改良型，激素以NAA，2，4-D，6-BA最为常用，均能使细胞正常生长。其中以2，4-D效果最好，2，4-D与6-BA组合效果更佳。悬浮培养的继代周期一般为18～20 d，此时的细胞生长旺盛，状态好，细胞量大。pH变化对西洋参细胞生长影响不大，pH 6.0时，最有利于人参皂苷Re和西洋参多糖的合成。接种量为25 g·L-1时，西洋参细胞的干重增殖倍数显著增加。培养温度为（24±1）℃，此时的细胞生长状态最好，颜色浅嫩黄色；生长量较大，生长速度快，延迟期短；在20℃和（28±1）℃时，细胞生长缓慢，尤其是28℃以上时细胞生长基本停止。光照显著促进西洋参细胞次生代谢物的合成，但对多糖合成没有太大影响[11-12]。

药用植物细胞大规模培养已经在人参和紫草等植物上取得了成功[13-15]。目前实验室常用的是气升式发酵罐，相对于机械搅拌式发酵罐采用气升式发酵罐更适合于植物细胞的大量培养[16]。采用40 L的气升式发酵罐对西洋参细胞进行放大培养，考察气升式反应器内培养过程中的流变学特性、传质特性以及流场剪切应力变化规律，为以后的扩大培养及发酵罐的设计提供了有力的理论依据。通过两步培养法，综合考察蔗糖、MJ（茉莉酸甲酯）和LH（水解乳蛋白）可以使西洋参悬浮细胞中的皂苷产量比补料培养提高4.03倍，达到31.52 mg·L-1，为工业化培养中提高皂苷产量提供了一个新的思路[17]。

3 西洋参毛状根与冠瘿组织培养

毛状根（Dairy Roots）是发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。西洋参的叶很难诱导毛状根，叶柄则较为容易，尤其是带部分叶的叶柄生命力强，也更易获得毛状根。西洋参毛状根的建立已有成功的报道[18]。Archana Mathur等[19]将Ri-TL整合到rolA，rolB和rolC基因转化获得毛状根经八周培养可增值10倍以上，皂苷产量达到0.2 g·g-1（干重）。贾冬梅等[20]利用发根农杆菌 A4菌株在西洋参根外植体上直接诱导产生发根，在1／2MS和MS固体培养基上得到西洋参发根，并在B5液体培养基上建立起发根离体培养系，利用紫外分光光度法测得西洋参发根的总皂苷含量达3.88%。

冠瘿组织是指经根瘤农杆菌的Ti质粒转化形成的转基因器官——冠瘿瘤（Crown Gall）。高盐浓度的MS培养基最有利于西洋参冠瘿组织的生长和人参皂苷Re的合成。蔗糖浓度为4%时，最利于组织的生长和总皂苷的累积，葡萄糖的加入会抑制冠瘿组织生长和总皂苷的累积。NH4+用量一定的情况下，MS培养基中添加硝基氮，能够明显促进总皂苷的累积。冠瘿组织最适生长温度25℃，总皂苷累积的最适温度为20℃。pH 5.2～5.6有利于总皂苷的累积，过高既不利于组织生长，也不利于皂苷的累积。接种量在2～6（gFW／flask）时，对西洋参冠瘿组织生长较为有利；接种量为6（gFW／flask）时，人参皂苷Rb1含量明显高于其他[21-23]。

对西洋参冠瘿组织生物转化能力的研究近年来成了一个新的热点。西洋参冠瘿组织具有促进植物体内的芳香族化合物糖基化、羟基化和甲基化反应的能力，如丹皮酚经西洋参冠瘿组织可转化为β-葡萄糖苷、1-（2，4-二甲氧基）-乙酮、β-葡萄糖苷[大黄素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及其羟基衍生物，而大黄素也可转化为β-葡萄糖苷[大黄素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及其羟基衍生物[24]。Lin Yang等[25]也通过实验表明西洋参冠瘿组织的糖基化能力要远强于烟草细胞悬浮体系。

毛状根和冠瘿组织培养是近些年才兴起的培养系统，所以仍存在很多亟待解决的问题。由于西洋参与人参在植物形态、植物化学、细胞生理等方面很相似，因此，西洋参毛状根的培养可借鉴人参毛状根培养方面的研究报道[26-27]。另外离体毛状根和冠瘿组织往往不能合成所需产物，利用毛状根和冠瘿组织共培养、Ti和Ri质粒对植物进行双转化，可以有效解决此类问题[28-29]。

4 西洋参组织培养中提高有效成分含量的方法

有效成分含量的提高是药用植物组织培养的难点，也是必须解决的问题。目前已经工业化培养成功的人参组织培养，皂苷含量比较稳定[30-31]。在西洋参细胞培养液中加入甘露醇，能明显提高人参皂苷的含量，其含量是未加甘露醇含量的3倍，但渗透压的提高对细胞的生长不利，导致生物量下降，影响人参皂苷产量[32]。而通过两步培养法可以较好地处理培养过程中对细胞生长的不利因素，提高人参皂苷的产量[17]。在人参毛状根的培养中，先把人参毛状根在附加IBA（即3-吲哚丁酸）0.5mg·L-1的MS培养基中预培养72h后，再转入不加激素的MS培养基中，6周后毛状根中总皂苷含量达到5.19%，单体皂苷Re和Rg含量之和达到0.3271%[33]，此方法对西洋参毛状根培养有一定的参考价值。

向细胞培养基中添加诱导子及前体化合物是提高有效成分含量的常用方法。常用的诱导子有MJ（茉莉酸甲酯）、LH（水解乳蛋白）、SA（水杨酸）和酵母提取物等。实验表明多种诱导子的联合应用可以更好地促进人参皂苷的积累。把红花、人参、黑节草寡糖素添加到培养基中后，可使西洋参悬浮培养中Rg组的皂苷含量提高1.83倍[34]。方绮民等[35]在悬浮培养液中加入葡枝根霉，使西洋参中皂苷含量提2倍，且不减慢细胞的生长速率，皂苷产率高。在西洋参细胞悬浮培养中添加促进皂苷生物合成的3个前体：乙酸钠、脚牛儿醇和角鲨烯，均可提高培养物中人参皂苷的含量[36]。此外，乙酸钠也可以提高植物甾醇含量。3种前体中角鲨烯提高皂苷含量最为有效。

外源性植物激素的加入对培养物的生长及次生代谢产物的合成也会有一定的作用。常用的外源激素有萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）等。2，4-D 2mg·L-1、KT（0.05～0.1 mg·L-1）对西洋参愈伤组织中总皂苷产生有一定的促进作用[3]。2，4-D对Rb1的影响明显，而2，4-D 0.5 mg·L-1较为适合Re的形成[37]。