冷冻干燥法保藏放线菌菌株32 ～ 39年存活性试验

苏静，王桂兰，赵仪英，余利岩，刘红宇

冷冻干燥保藏法，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。文献报道一般保藏时间达 5 ～ 15 年，所以传代转种的间隔是 5 ～ 10 年。国内尚未有保藏时间超过 30 年的文献报道。本文将 1972 – 1979 年间采用冷冻干燥法保存的 120 株菌种复壮，发现此法保藏的菌株经过 32 ～39 年的保存，总存活率高达 83.3%。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 链霉菌属（Streptomyces）53 个种116 株、游动放线菌属（Actinoplanes）1 株、诺卡菌属（Nocardia）2 株、链轮丝菌属（Streptoverticillium）1 株，均来源于本所药用微生物菌种保藏中心。

1.1.2 传代斜面[1]高氏一号培养基为广东环凯微生物科技有限公司产品；ISP2 培养基为碧迪医疗器械（上海）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 冷冻干燥保存法[2-4]冷冻干燥保藏法是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞或孢子悬液于安瓿管中，在低温下（低于共晶点 10 ～ 20 ℃）将菌悬液冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水，形成完全干燥的固体菌块。然后在真空条件下融封，造成无氧真空环境，置 4 ℃ 低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。保护剂通常为 10%脱脂牛奶。

1.2.2 菌种复壮 用 70% 酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签蘸冷水，在顶部擦 1 圈，顶部出现裂纹后，用镊子在裂纹部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用灭菌水溶解菌块，使用无菌吸管吸取菌悬液涂布于高氏一号和 ISP2 斜面培养基上，于 28 ℃ 培养 25 d。观察斜面，有 1 个及以上菌落生长视为该菌存活。

2 结果

把从 1972 – 1979 年保存的菌种按照冷冻干燥保藏法的复壮方法进行全面复壮，观察其菌丝生长情况。共检测接种放线菌 120 株，其中的 80 株可以产生各种生理活性物质。120 株菌株中有游动放线菌属 1 株，存活 32 年；诺卡菌属 2 株，均存活 34 年以上；链轮丝菌属 1 株，存活32 年；链霉菌属 53 个种，116 株，其中 96 株存活32 年以上，总存活率高达 83.3%（表 1）。

表 1 放线菌保藏 32 ～ 39 年后存活情况

续表 1

续表 1

3 讨论

在使用冷冻干燥法保藏菌种的过程中，影响菌种存活率的因素很多，如菌种差异，保藏前使用的培养基，菌种的生长状况，保护剂、冻干曲线是否合适，冻干后的存放地点，复壮条件等。药用微生物菌种保藏中心从 20 世纪 60 年代末开始采用冷冻干燥技术保藏放线菌。从上述的存活性实验结果可以看出，采用冷冻干燥法长期保藏放线菌是十分有效的。

在冷冻干燥法的过程中严格控制冷冻干燥保藏的各个环节，可以延长菌种保藏时间，提高保藏效率。特别是以下几个环节值得注意：

⑴选择易产孢培养基，尽可能缩短待冻干菌种于4 ℃ 冰箱放置时间。

⑵设定合适的冻干曲线。由于过去的小型冻干机层板温度和真空度无法控制，不能保证样品在主冻干过程中，温度始终低于共晶点 10 ～ 20 ℃，造成菌种不能完全在升华状态下被抽干水分，影响菌种的保藏效果。目前，本中心正在对冷冻干燥整个流程的各个环节进行质量控制，购置了中试型冻干机，全面控制冻干曲线[4]，以延长微生物菌种保藏时间。

[1] Zhang JZ. Microbial taxonomy. Shanghai: Fudan University Press,1990:153-154. (in Chinese)张纪中. 微生物分类学. 上海: 复旦大学出版社, 1990:153-154.

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[3] Institute of microbiology culture collection manual preparation group. Culture collection manual. Beijng: Science Press, 1980:615-616. (in Chinese)中国科学院微生物研究所菌种保藏手册编制组. 菌种保藏手册.北京: 科学出版社, 1980:615-616.

[4] John GD, Glyn NS. Cryopreservation and freeze-drying protocols(Methods in molecular biology). 2nd Ed. Totowa, New Jersey:Humana Press, 2007.