青藤碱对环瓜氨酸肽刺激类风湿关节炎T细胞分泌INF-γ及IL-4的影响*

姚茹冰 高佩芳 蔡 辉

（南京军区南京总医院，江苏 南京 210002）

近年研究提示，环瓜氨酸肽及其相关抗原是类风湿关节炎（RA）发病过程中的原发致病靶抗原，在一定易感基因背景下，特定蛋白或多肽瓜氨酸化可能作为RA发病的初始抗原发挥致病作用。青藤碱用于治疗RA有较好的抗炎和免疫抑制作用［1-3］。本文观察青藤碱对环瓜氨酸肽刺激的RA患者外周血T细胞体外分泌干扰素（INF）-γ和白细胞介素（IL）-4等细胞因子的影响，以期深入了解青藤碱治疗RA的相关机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2009年5月至2009年9月本院就诊的24例RA患者，均符合美国风湿病学会（ACR）1987年RA诊断标准［4］。同时满足以下入选条件：血清抗环瓜氨酸肽抗体阳性；近1个月内未用过免疫抑制剂；近1个月内未服用＞10 mg/d（按泼尼松剂量计算）的肾上腺糖皮质激素。其中女性19例，男性5例；年龄 28～81 岁；病程 3 个月至 40 年，平均（8.7±2.6）年。

1.2 试剂与仪器 人工合成环瓜氨酸肽 （环瓜氨酸肽–HQC/HQE/STX/GRS/RGR/CGRSGS-）由上海华大天源公司合成制备，纯度＞95.0%；青藤碱干粉（中国药品生物制品检定所）；注射用MTX 5 mg/支 （上海华联制药）；Hyclone改良型RPMI1640培养基 （含25 mmol/L Hepes和2 mmol/L谷氨酰胺），Gibco公司产品；人外周血淋巴细胞分离液，TBD公司产品；胎牛血清，杭州四季青公司产品；植物血凝素 （PHA），Sigma公司产品；IFN-γ和IL-4试剂盒为美国R&D公司进口分装产品。台式水平离心机（安徽科大创新），超净工作台 （苏州安泰），CO2培养箱 （美国NAPCO公司），荧光倒置显微镜 （日本OLYMPUS公司），BIORADModel680酶标仪 （美国Bio-Rad公司）；96孔和24孔细胞培养板（美国Corning公司）。

1.3 人外周血淋巴细胞分离、培养 无菌采取肝素抗凝静脉血6～8 mL，1000 r/min离心5 min，取适量血浆于-20℃冻存备用。去血浆后的血细胞用生理盐水重悬，用Ficoll密度梯度离心（2100 r/min离心25 min），缓慢吸取白雾状淋巴细胞层。将收集到的淋巴细胞集中于一支离心管中，用5倍于细胞悬液的1640培养基（不含血清）洗涤2次，以2000 r/min和1500 r/min各离心10 min，弃大部分上清。将洗涤后得到的淋巴细胞团用少量RPIM1640培养基（含10%胎牛血清、10 μg/mL PHA）轻轻打散，血细胞计数板统计并调节细胞浓度至1×106/mL，于细胞悬液中加入10%的自体血浆［5］，混匀。分别接种于96孔和24孔细胞培养板。

1.4 干预方法 分为4组进行干预。空白对照组：不加任何干预药物；环瓜氨酸肽组：仅加环瓜氨酸肽干预（环瓜氨酸肽终质量浓度为20 μg/mL）；甲氨蝶呤组：同时加环瓜氨酸肽与甲氨蝶呤干预（环瓜氨酸肽与甲氨蝶呤终质量浓度均为20 μg/mL）；青藤碱组：同时加环瓜氨酸肽与青藤碱干预（环瓜氨酸肽与青藤碱终质量浓度均为20 μg/mL）；每组设2个复孔。置于37℃ 5%CO2培养箱中培养。

1.5 标本采集与检测 细胞培养72 h后，收集24孔板细胞上清，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定IFN–γ和IL-4的含量，经对倍稀释后，严格按ELISA试剂盒说明书操作。于酶标仪450/630 nm双波长下读取吸光度（OD）值。根据标准曲线，换算出样品中IFN–γ和IL-4质量浓度。

1.6 统计学处理 应用SPSS15.0统计软件。样本干预前后采用配对样本t检验，数据以（±se）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组RA患者T细胞分泌IFN–γ的影响 见表1。与空白对照组相比，环瓜氨酸肽组IFN-γ升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。甲氨蝶呤组、青藤碱组与环瓜氨酸肽组相比，IFN-γ均有所下降，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）。

表1 各组患者T细胞分泌IFN–γ、IL-4水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组患者T细胞分泌IFN–γ、IL-4水平比较（pg/mL，±s）

与环瓜氨酸肽组比较，*P＜0.01；与空白对照组比较，△P＜0.05。

组 别 n IL-4 IFN-γ空白对照组 24 62.95±6.88 182.45±20.95环瓜氨酸肽组 24 56.67±7.39△ 195.32±19.55△甲氨蝶呤组 24 103.30±20.88* 189.22±20.89*青藤碱组 24 102.12±19.75* 186.32±21.04*

2.2 各组RA患者T细胞分泌IL-4的影响 见表1。与空白对照组相比，环瓜氨酸肽组分泌IL-4降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。甲氨蝶呤组、青藤碱组与环瓜氨酸肽组相比，IL-4均有明显升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）。

3 讨 论

RA是一种以对称性、多关节受累为主要表现的慢性全身性自身免疫性疾病，确切发病机制尚不清楚。现有研究提示，抗原提供的抗原性刺激为T细胞的激活提供重要信号，细胞免疫调节异常是RA发病关键。RA滑膜组织病理学表现为大量的T淋巴细胞浸润，也为RA是由T细胞介导的疾病提供证据。研究发现浸润到滑膜的CD4+、CD28-T细胞不需要共刺激信号 （或通过其他信号转导）就能产生过量的IFN-γ，它们还表达穿孔素，溶解细胞，诱发炎症。T细胞被不明因素激活后分泌的IFN-γ等致炎细胞因子，同时IL-4等抑炎因子的分泌异常，共同参与RA的诱发和延续，最终导致骨、关节的破坏。2000年，外国学者Schellekens首次人工合成环瓜氨酸肽，并用ELISA法在RA患者中检测到抗环瓜氨酸肽抗体，有很好的敏感性和很高的特异性，分别为68%和98%，研究同时发现抗环瓜氨酸肽抗体阳性是发展为RA最重要预测因素之一，也是侵蚀性关节损害的一个重要标志及危险因素［6-7］，总之，环瓜氨酸肽及其相关抗原是RA发病的重要靶抗原之一已成为目前研究的共识［8］。

本实验将环瓜氨酸肽作为抗原，体外干预RA患者外周血淋巴细胞，与环瓜氨酸肽干预前相比，RA患者分泌的致炎因子IFN-γ升高，抑炎因子IL-4下降，差异有统计学意义 （P均＜0.05）。这与国内学者报道的环瓜氨酸肽可以促进RA患者T淋巴细胞的增殖，导致T细胞异常活化，从而参与RA的致病过程的结论是一致的［9］。进一步干预此过程将有助于更好治疗RA。已有的青藤碱治疗RA的临床和实验研究，提示其对RA有较好的治疗作用，青藤碱可抑制T淋巴细胞活化和增殖，显著降低T细胞内细胞因子TNF-γ、TNF-α分子表达［10-11］。本实验在此基础上，进一步在细胞水平上研究青藤碱治疗RA可能的作用机制。结果显示，与RA环瓜氨酸肽组相比，青藤碱可抑制环瓜氨酸肽刺激RA患者的T细胞分泌致炎因子IFN-γ，增加抑炎因子IL-4分泌，差异具有统计学意义（P均＜0.01）。

总之，青藤碱可调节环瓜氨酸肽刺激的RA患者外周血T细胞分泌的相关致炎因子及抑炎因子，可能在RA的治疗中发挥重要作用，具体的机制有待于进一步探讨。

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［5］Laura Fraccaroli，Julio Alfieri，Luciana Larocca，et al.A potential tolerogenic immune mechanism in a trophoblast cell line through the activation of chemokine induced T cell death and regulatory T cell modulation［J］.Human Reproduction，2009，24：166-175.

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