狂犬病毒的分子生物学研究进展

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(湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(RV)引起的一种以中枢神经系统感染为特征的人兽共患传染病，是全球病死率最高的急性传染病之一，一旦感染发病，死亡率几乎高达100%。

1 狂犬病毒的基因组结构

狂犬病病毒在分类学上属单分子负链RNA 病毒目、弹状病毒科、狂犬病毒属，具有典型的子弹状形态的包膜病毒，长170～180 nm，直径75～80 nm，具有单股负链RNA基因组，有典型的基因组结构和基因表达方式，遗传信息以超螺旋的核糖核蛋白复合体(RNP)形式储存。

RV基因组全长约12 kb,相对分子质量约4.6×106，包括3′端的先导区、N、P、M、G、L 5个连续的结构基因及5′端的非翻译区共七个部分。 5个结构基因的顺序是3′-N-P-M-G-L-5′，该顺序在RV中高度保守，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录大蛋白。各结构基因之间具有核苷酸数目不等的非转录间隔区。

2 影响狂犬病毒致病性的因素

2.1糖蛋白 编码糖蛋白的G基因由1575个核苷酸组成。依据功能不同，分为4个区：1～57位核苷酸为信号肽编码区，58～1374位核苷酸为膜外区编码区，1375～1440位核苷酸为跨膜区编码区，1441～1575位核苷酸为膜内区编码区。G基因只有一个开放读码框(ORF)，编码524个氨基酸糖蛋白前体。

病毒粒子表面的糖蛋白是狂犬病毒嗜神经性的主要决定物质，糖蛋白能与存在于神经细胞表面的细胞受体发生特异性结合反应，从而决定了狂犬病毒的神经嗜性。据Gastka M等(1996)[1]报道，研究发现在神经肌肉连接处能检测到核糖核蛋白(RNP)，糖蛋白的189～214位氨基酸序列与蛇神经毒素的氨基酸序列有很高的同源性，银环蛇毒素或D-筒毒素能阻断狂犬病毒结合到肌管上。动物实验表明，动物对狂犬病毒的易感性与肌肉组织中烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的含量密切相关，被认为是与狂犬病毒糖蛋白结合的受体。除nAChR外，磷脂、神经节苷脂、神经细胞粘附分子及神经生长因子等也可能是狂犬病毒的受体，Thoulouze等(1998)[2]证实，神经细胞粘附因子(NCAM)是狂犬病毒糖蛋白的受体，无NCAM 的细胞转染了NCAM基因后对狂犬病毒的易感性明显提高，用可降解NCAM 的试剂先行孵育细胞，则狂犬病毒不易感染细胞。另外，天然的狂犬病毒糖蛋白可以与p75神经营养因子受体(p75NTR)结合，感染神经细胞[3]。由于这些受体表达于神经细胞表面，因此糖蛋白与这些受体结合使病毒固定在细胞上，之后以胞饮方式进入细胞，在糖蛋白的作用下使病毒膜与溶酶体液泡融合，把RNP释放到细胞质中，通过这种途径决定了狂犬病毒的神经嗜性。

糖蛋白的结构与病毒毒力有着密切关系。研究发现狂犬病毒糖蛋白膜外区330位的赖氨酸和333位的精氨酸分别被天门冬氨酸和甲硫丁氨酸取代可明显降低G和神经瘤细胞之间的相互作用，形成的双突变狂犬病毒株对成年小鼠无致病性[4]。据Dietzschold B(1983)[5]研究发现，当糖蛋白氨基酸序列的第333位精氨酸被异亮氨酸、谷酰胺、谷氨酸或甘氨酸替换，不论以何种剂量、何种途径用狂犬病毒感染小鼠，均无致病性，这是由于这种突变可以阻止运动神经元的感染和病毒在成神经瘤细胞培养中的传播。但值得注意的是不是所有333位的氨基酸突变都能降低病毒株的毒力，Tuffereau等发现用333位氨基酸突变株免疫1～2日龄乳鼠，则可引起乳鼠发病[6]。糖蛋白的第164～303位氨基酸与狂犬病毒对成年鼠的致死性作用有关，其中第242、255、268位氨基酸能增强狂犬病毒的毒力。Takayama-Ito M等(2006)[7]研究发现，无致病性毒株第194位的天冬酰胺若被赖氨酸替换，则能增强狂犬病毒突变株的毒力，使病毒对宿主的致病性能力提高。

作为狂犬病毒中唯一的糖基化蛋白，糖蛋白的糖基化与病毒毒力及致病性密切相关。糖基化决定其稳定性、抗原性及生物学活性，在糖蛋白的表达与分泌中起着关键的作用。每个糖蛋白分子上有3～4个糖基化位点，不同毒株糖基化的数量和位置不完全相同，但319位点存在于目前所有测序的糖蛋白上，此位点关系着糖蛋白的正确折叠和加工运输。基因Ⅰ型的多数毒株37位可被糖基化，另外158、247、319等处也是Ⅰ型病毒潜在的糖基化位点，其它型病毒的糖蛋白则分别在202、319(Mokola)、247(Duvenhage)、184、202、334(Lagos bat)出现多处潜在的糖基化位点[8、9]。Buger将感染RV的细胞用一种能阻断糖基化的突尼卡霉素处理后，完全阻断了糖蛋白在细胞膜上的表达，进而影响狂犬病毒的毒力[10]。

2.2细胞凋亡 糖蛋白与宿主神经细胞凋亡有关。现有研究表明，病毒株的致病性与诱导细胞凋亡的能力成反比。Jackson等(1997)[11]证实，有致病性的狂犬病毒侵袭中枢神经系统后能诱导神经细胞发生凋亡，说明细胞凋亡与病毒的致病机理有一定的关系。据Pulmanausahakul R等(2001)[12]研究发现，表达细胞色素C的重组狂犬病毒，通过外周途径感染小鼠，发现病毒致病性明显降低，这是因进入细胞浆的细胞色素C在dATP 存在的条件下能与凋亡相关因子1(Apaf-1)结合，使其形成多聚体，促使半胱天冬蛋白酶9(caspase-9)与其结合形成凋亡小体，caspase-9 被激活，被激活的caspase-9 能激活其它caspase，如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。单独表达狂犬病毒糖蛋白就能充分诱导细胞凋亡，Prehaud等(2003)[13]研究表明，克隆狂犬病毒G 基因的重组体在诱导表达系统的帮助下能诱导细胞凋亡，且发现来源于ERA减毒株的G 基因较来源于CVS攻击毒株的G 基因更容易诱导细胞发生半胱天冬蛋白酶依赖的细胞凋亡。另外，狂犬病毒减毒株能诱导涉及凋亡诱导因子AIF 的不依赖半胱天冬蛋白酶的细胞凋亡。以上两种细胞凋亡途径可被Bcl-2 基因的过度表达所抑制，表明Bcl-2 基因的增量调节对感染细胞中的病毒具有保护作用，这是因为Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽(GSH)的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性，抑制细胞凋亡。因此，由于细胞的凋亡,限制了病毒的感染。

3 狂犬病毒的繁殖过程

狂犬病毒糖蛋白与细胞受体结合后进入细胞，在糖蛋白的作用下，把核衣壳释放到细胞质中，病毒在细胞质中进行转录、翻译、复制，然后组装成新的病毒粒子，完成病毒的繁殖过程。

弹状病毒mRNA 的转录是从基因组3′端启动子处发生的，连续合成单顺反子mRNA，RNA 聚合酶在每个基因的边界都会发生部分的解离，使得从3′端到5′端基因的转录产物越来越少，形成一个转录梯度。狂犬病毒5个基因间隔区的核苷酸数目不一样，使得越靠近5′端的基因受间隔区的影响越大，尤其是L 基因，其转录产物几乎不能被检测到。Finke S等(2000)[14]发现，当用P-M、M-G、G-L之间的间隔区核苷酸替换N-P之间的核苷酸，下游基因的转录产物分别下降22%、19%、89%，证明了基因间隔区对基因转录的调控作用，间隔区越长，下游基因转录越少。相反，当用N-P基因之间的间隔区序列替换G-L基因之间的序列，发现L 基因的mRNA 的表达量和病毒RNA 的合成都普遍增加。表明狂犬病毒演化了一套独特的调节转录机制来影响病毒的复制能力。

狂犬病毒mRNA 是以细胞的翻译机制被翻译,大部分在细胞质中游离的多核糖体中表达。但是，G 蛋白是在粗面内质网中翻译产生，再经过高尔基体被转运到细胞膜上。狂犬病毒基因组的复制是以核糖核蛋白复合体作为模板，复制是在协调因子P 蛋白的参与下，由病毒RNA 依赖的RNA 聚合酶催化完成的。

值得注意的是，M 蛋白对病毒的转录复制也具有重要的调控作用。据Finke S等(2001)[15]研究发现，当缺少M 蛋白时，狂犬病毒的复制受到限制，基因转录效率提高，转录产物增加；当增加M 蛋白时，转录效率下降，复制增加。

4 狂犬病毒载体的研究进展

据Inoue K等(2003)[16]研究发现，狂犬病毒在宿主体内能诱导产生高效的体液免疫和细胞免疫，故狂犬病毒作为载体在疫苗制备方面具有广泛的用途。狂犬病毒载体在保留糖蛋白作为主要的保护性抗原的同时，关键是要避免病毒本身的神经致病性。目前降低病毒致病性的常用途径有两种：一是对糖蛋白主要抗原位点的氨基酸突变来降低病毒的毒力；二是通过反向遗传学技术拯救病毒。到目前为止，已经拯救了3株狂犬病毒弱毒株，分别为SAD B19、HEP-Flury 和RC-HL。

目前用作载体的狂犬病毒多为SAD B19弱毒株。用该载体表达艾滋病、丙型肝炎等病毒抗原的实验研究都取得了很好的效果。最近，Smith ME等(2006)[17]用狂犬病毒糖蛋白作为转移载体表达炭疽保护性抗原，免疫小鼠有一定的保护效果。狂犬病毒的高治病性，使狂犬病毒载体的使用受到质疑。但是，因为病毒在人体内的血清阳性率较低，故狂犬病毒作为载体具有很大的发展潜力。

狂犬病是全球性的严重公共卫生问题，全世界估计每年有数万人死于该病，故对狂犬病毒的研究显得尤为重要。对病毒致病性及繁殖过程中关键步骤分子机理的深入研究，有助于狂犬病毒高度弱毒株和狂犬病毒载体的合理设计，而且对研究治疗狂犬病毒或其他负链RNA 病毒的特异性抗病毒药物具有很大的帮助。

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