蛋白质分离纯化方法研究进展

吴少辉，刘光明

（大理学院药学院，云南 大理 671000）

蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中（包括催化代谢反应、物质运转、兴奋的传导、生长发育的控制等）起着重要的作用，因此，蛋白质是生命科学极为重要的研究对象。蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中不可缺少的环节，只有了解蛋白质的分子量、溶解性、等电点以及稳定性等基本性质，才能达到有效分离。

1 基于分子大小差异的分离技术

1.1 凝胶层析

凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析，是利用凝胶的网状结构，根据分子大小差异分离混合物的方法。由于该法上样量有限，常用在纯化的最后一步，并与其他分离方法（如离子交换[1]）组合使用。分离过程中，在保证原有生物活性的基础上考虑装柱、流速、洗脱液的选择以及其他影响因素，最终确定合适的分离条件[2]。张及禄等[3]采用葡聚糖凝胶50（Sephadex G－50）等层析材料从白山岩栖蝮蛇蛇毒中分离纯化出小分子多肽Saxis。张勇等[4]通过凝胶层析分离家蝇幼虫血淋巴，得到了对真菌有抑制作用的组分。罗轻蕾等[5]通过硫酸铵沉淀和Sephadex G－200凝胶层析结合的方法，分离纯化出美国红鱼血清免疫球蛋白。

1.2 超滤

超滤法是利用加压膜分离技术，在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜，大分子溶质滞留，从而使大分子物质得到部分的纯化。该法操作简便、成本低廉、试验条件温和，不需加热，与蒸发、冰冻干燥相比没有相变化、pH变化，因而可以防止生物活性物质的变性、失活和自溶[6]。张秀媛等[7]研究了超滤法分离纯化酪蛋白糖巨肽（CGMP）的条件，得到的最佳条件是在室温下，压差为0.02MPa，浓缩比为8。

1.3 透析

透析是利用小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将无机盐等小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术，常和盐析、盐溶等方法联合使用。肖桂秀[8]通过凝胶色谱法、透析法和乙醇沉淀法对羚羊角塞水提液中的蛋白质、氨基酸等进行分离，透析结果表明，大的蛋白质分子和小的氨基酸分子得到初步分离。李任强等[9]根据蚯蚓体内血红蛋白分子结构的特性与分布状态，采用了双水相萃取等工艺，分离纯化了生物态含铁蛋白质，获得了高纯度的蚯蚓含铁蛋白。

2 基于溶解度差异的分离纯化技术

2.1 等电点法

等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低且各种蛋白质等电点不同的特点进行分离的方法。徐律等[10]利用等电点法在鱼糜漂洗水中提取鱼蛋白，提取率达83.33％，该法具有操作简单，提取率高等优点。陈申如等[11]用酸法提取鲢鱼鱼肉蛋白质，最适pH为2.39，该方法提取的鲢鱼肉蛋白质无腥味，色泽洁白，产率高。

2.2 溶剂法

溶剂提取法包括水溶液提取法和有机溶剂提取法，其中缓冲溶液对蛋白质的溶解度大、稳定性好，最为常用；而乙醇、丁醇和丙酮等有机溶剂具有一定的亲水性和较强的亲脂性，主要用于一些脂质结合较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶。其中乙醇提取法溶解性能较好、溶出的水溶性杂质少、可回收反复利用。丁醇在一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶提取中更加优越，溶解脂的能力强，兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活[12]。

2.3 双水相萃取法

双水相萃取技术是一种新型的分离技术。它把两种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起，由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不溶性形成两相，与传统的分离技术相比，具有操作条件温和、处理量大、易连续操作等优点，同时克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，在粗提过程中保持了生物物质的活性及构象等优势[13－14]。该技术现已成功地应用于分离蛋白质、抗生素微生物离子、电泳分离氨基酸等。采用双水相系统浓缩目的蛋白，受聚合物分子量及浓度、溶液pH、离子强度、盐类型及浓度的影响[15]。刘杨等[16]以聚乙二醇（PEG）/硫酸钠双水相体系，经一次萃取，从钝顶螺旋藻（Spirulinaplatensis）细胞破碎液中富集分离得到藻蓝蛋白。

反胶团萃取是指胶团内可溶解少量水而形成微型水池，利用胶团对外界有机溶剂的屏蔽作用，实现生物物质的溶解和分离。该技术具有选择性高、萃取过程简单，正萃、反萃同时进行，能有效防止大分子失活、变性。其不足之处包括：普通离子型表面活性剂可能对产品产生污染；常用的离子型表面活性剂容易造成蛋白质的变性和失活，虽然活性损失较少[17－18]。其影响因素主要包括表面活性剂种类以及浓度、离子强度、助表面活性剂、水相pH和温度等[19]。反胶团萃取法还可提取蛋白质、酶、核酸、氨基酸和多肽。刘俊果等[20]利用反胶团萃取技术分离纯化了新型溶栓药物纳豆激酶。

2.4 盐溶法及盐析法

许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，该现象称为盐溶；而当盐浓度继续增加时，蛋白质又会自动析出，该现象称为盐析。盐溶和盐析主要是通过影响蛋白质分子表面的电荷而分离、纯化蛋白质。黄雄伟[21]报道，提取黄粉虫蛋白质的最佳工艺条件是氯化钠0.5％，提取温度50℃，液固比8∶1（体积质量比），提取时间3h，蛋白质沉淀pH=4.8。

盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、溶解度大等优点，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、pH及温度等因素影响。李媛等[22]在家蚕丝素RGD融合蛋白的盐析纯化工艺研究中，得到的最优纯化条件为pH=8，硫酸铵在溶液中的饱和度为20％，室温。

上述两种方法分离纯化蛋白质后，都要采用凝胶过滤或透析除盐[22]。

3 基于电荷不同的分离技术

3.1 离子交换层析

离子交换层析是发展最早的层析技术之一，目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段。离子交换层析以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物质的衍生物为载体，在某一pH条件下，这些载体带有正电荷或负电荷，当待分离蛋白质分子通过载体时，离子交换使蛋白质分子分离纯化。胡鹏等[23]通过DEAE－Sepharose－FF琼脂糖凝胶离子交换层析法，对牛背最长肌中钙激活酶进行了分离纯化，并确定了最佳分离条件。

3.2 电泳技术

电泳技术作为分离纯化蛋白质的手段之一，无论是单向凝胶电泳还是双向凝胶电泳，都是分离度极高的分离方法，可分为变性电泳、常规电泳、等电聚焦电泳和毛细管电泳。获得分离的蛋白质，均可用电洗脱或电转印到硝酸纤维素膜上直接进行序列分析。吴序栎等[24]通过十二烷基硫酸钠 －聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离鸡蛋的蛋白质组分，采用免疫印迹方法鉴定过敏原，通过离子交换层析对鸡蛋主要过敏原进行了初步纯化。

4 基于对配体亲和力差异的分离技术

亲和层析是一种以样品的生物活性为依据的分离技术。分析膜蛋白方法是利用蛋白质能和某些专一分子可逆结合的特性而发展起来的层析技术。当蛋白质溶液通过层析柱时，其中可与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合，不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体，从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开，而后利用高浓度的底物溶液或亲和力更强的底物衍生溶液洗脱目标蛋白，即可脱离层析柱上的载体。1983年Anastasi等[25]采用亲和层析方法，首次在鸡蛋清中分离得到了两种不同 PI值（6.5和5.6）的蛋白质。

5 基于选择性吸附差异的分离方法

疏水层析是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合的特性进行分离。在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，其他的杂质蛋白则无此种性质，从而使蛋白质初步分离。该方法具有使蛋白质变性、仅适合部分蛋白质等缺点。吴银飞等[26]采用疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原（HBeAg）单克隆抗体（mAb），并对分离条件进行了优化。

6 其他方法

反相高效液相色谱法是一种以疏水作用为基础的色谱分离法，具有分辨率高、重复性好、回收率高等优点，在蛋白质及多肽的分离分析中得到了极其广泛的应用。

分子印迹是一种识别聚合物特殊结合位点的技术。随着分离蛋白质印迹聚合物的成功合成，蛋白质印迹技术已成为研究热点。

高效毛细管电泳技术是20世纪80年代问世的一种高效液相分离技术，是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物。目前，它已成为分析科学中最具活力的方法之一，因其分离效率高、分析速度快、样品用量少、抗污染能力强和易自动化等特点，被广泛应用于分子生物学、医学、药学以及高分子等多个领域。

作为蛋白质产品分离纯化的主流技术，柱层析具有很高的分离效率，通常采用固定床间歇操作方式，操作简单，但存在着载体利用率低和过程效率低的问题。

采用连续逆流操作层析，分离效率和产率均有提高，对于难分离体系，逆流层析过程是一种有效分离手段。

7 结语

到目前为止，还没有单一的方法能够分离、纯化出高纯度的蛋白质，应依据物理、化学以及生物学特性的不同，采用多种分离方法，以便在分离、纯化的同时，更好地保持蛋白质的生物学性质。因此，蛋白质的分离、纯化仍然是一项艰巨而繁重的任务。

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