缺血预处理对肺缺血再灌注损伤的保护作用

徐松涛

（复旦大学附属中山医院胸外科，上海 200032）

缺血预处理对肺缺血再灌注损伤的保护作用

徐松涛

（复旦大学附属中山医院胸外科，上海 200032）

缺血预处理（ischemia preconditioning，IP）通过对细胞或组织短暂的缺血－再灌注刺激，启动机体的内源性保护机制，获得相应细胞或组织对该刺激的耐受性，从而增强对其后更严重的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）的耐受。1986年，Murry等［1］在研究犬的心肌梗死模型时首先报告了IP的作用。后来的研究发现IP不但对缺血的心肌有保护作用，还对使用体外循环的心外科手术患者和经皮行冠状动脉介入手术的患者具有保护作用。除心肌外，在对脑、脊髓、肝、小肠、肾、骨骼肌和肺等的临床或动物研究中也都发现了IP可以不同程度地减轻相应器官的IRI［2－3］。

1 IP的保护机制

IP是很强的内源性保护机制，已有大量关于IP的启动、信号传导和效应的研究报道，但其确切的分子机制尚不清楚［3］。这些研究分散在不同的物种和组织器官，是否具有共同的作用机制仍然值得探讨。以研究最多的心肌为例，目前认为IP的作用机制是:短暂的缺血－再灌注诱导大量内源性物质释放，激活蛋白激酶C，再进一步激活其他激酶，改变细胞内的能量代谢、离子通道和细胞骨架，对相应器官以及远距器官的IRI产生不同程度的保护作用，包括减少氧自由基的形成、抑制活化中性粒细胞的释放、减少细胞凋亡和改善微循环等［2］。

1.1 IP的启动

IP作用的启动因子包括受体依赖型启动因子和受体非依赖型启动因子。

1.1.1 膜受体 受体依赖型启动因子包括腺苷、缓激肽、阿片肽、前列腺素、去甲肾上腺素、血管紧缩素、内皮素等。这些物质作用于相应的膜受体，且在预处理时就起作用。（1）腺苷受体:一般认为A1亚型与IP 有关［2，4－5］。Liu等［4］在研究家兔模型时发现，用腺苷血管内灌注5 min，冲洗10 min，可产生与IP相似的保护作用，而腺苷受体拮抗剂PD－11599或8－SPT则能阻断IP的保护作用。适当增加腺苷A1受体的表达（约为正常的30倍左右），可增加大鼠心脏对IRI的抵抗力，减少心肌梗死面积和再灌注后心脏收缩功能障碍［5］。（2）缓激肽受体:一般认为B2亚型与IP有关［6］。在较弱的IP刺激时，缓激肽是主要的触发因子；而IP刺激较强时，腺苷则为主要的触发因子。（3）阿片受体:Schultz等［6］在大鼠模型中发现灌流吗啡可以减少缺血范围，与IP的效应相似，且与δ亚型有关，这种作用可被阿片受体阻断剂纳络酮阻断，也可被ATP依赖型钾离子通道（ATP－sensitive potassium channel，K－ATP）阻断剂所消除。（4）其他受体:去甲肾上腺素通过α1受体介导其IP保护作用；血管紧张素Ⅱ通过AT1受体起作用；乙酰胆碱则通过M1受体发挥作用。这些触发物质的释放依动物种族、发动IP的缺血程度和时间的不同而不同。

1.1.2 受体非依赖型启动因子 包括一氧化氮（NO）、氧自由基（ROS）和钙［7］。用外源性 NO预处理供体可以产生和IP同样的心脏保护效果。在缺血缺氧过程中组织产生的氧自由基增加，氧自由基通过改变肌细胞的完整性以及增加细胞的流动性和通透性来造成细胞损伤。自由基可以激活G蛋白、蛋白酶和KATP，因而也起到IP启动因子的作用［7］。

1.2 IP的细胞内信号传导通路

包括G蛋白和早期磷脂酶C、延迟期磷脂酶D的活化。蛋白激酶（PKs）的活化级链通路依次包括蛋白激酶C（PKC），酪氨酸蛋白激酶（TK）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）［2］，这些介质在缺血等损伤时均发挥作用，阻断这些介质将消除IP的保护作用。

1.2.1 PKC PKC在调节IP中起主要作用。PKC能催化ATP的γ磷酸转移到丝氨酸或苏氨酸残基的氢氧根基团上。PKC能调节心肌细胞的离子电流，激活心肌K－ATP，充当 K－ATP开放剂。PKC至少包括11种丝氨酸或苏氨酸激酶；可分为3类:cPKC（α、βⅠ、βⅡ、γ）、nPKC（δ、ε、η、θ）和aPK（δ、ι、λ、μ）。IP保护心肌过程有多种因子参与，而PKC的转位与激活则是关键因素。

1.2.2 TK TK使蛋白质酪氨酸残基磷酸化，它在许多信号转导途径中都发挥着重要作用。TK抑制剂Genistein可以消除IP的保护作用。IP选择性激活TK家族的Src和Lck两个成员，但这种激活又可以被PKC拮抗剂白屈菜红碱所阻断，提示在IP的信号传导通路上，TK家族位于PKC的下游［8］。

1.2.3 MAPK MAPK是一类广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，是缺血、缺氧、牵张以及激素、生长因子和细胞因子等各种细胞外刺激诱导基因表达、细胞增殖等核反应的共同通路或汇聚点。G蛋白或TK的活化都可以激活Raf－MAPK的磷酸化连锁反应，经过MAPK的核转位，引起转录因子磷酸化，调节原癌基因、应急蛋白基因的表达，促进有关蛋白质合成增加，完成对细胞外刺激的反应。3个主要的MAPK通路与心脏含3种激酶（ERK、JNK和P38）相一致，很多报告提示JNK和/（或）P38 MAPK组成的通路与IP有关［2］，MAPK超家族在IP中的激活也可以被白屈菜红碱所阻断，提示它们也位于IP信号传导通路中的下游［8］。

1.3 IP的效应器

胞内ATP、糖类和蛋白质，离子通道（K－ATP或Na－H泵）和细胞骨架的介质。IP可以减少IRI过程中的能量需求，减缓代谢产物的堆积，减少糖酵解。IP产生的对组织起延迟期保护作用的介质包括NO合成酶（NOS）、COX－2、醛糖还原酶、Mn－SOD、热休克蛋白和K－ATP等。K－ATP通道在IP中起着终末效应器的作用［2，9］。K－ATP通道根据其在细胞内的位置不同而分为肌膜型和线粒体型。肌膜型KATP通道能够被特异性的抑制剂格列本脲或其他磺酰脲类药物阻断，从而消除了IP的保护效应；线粒体K－ATP通道可特异地被二氮嗪开放和被低浓度的5－羟基癸酸阻断。

综上所述，IP的生物学机制是一个由受体、蛋白激酶和离子通道等参与的复杂过程，许多内源性保护物质如腺苷、缓激肽、阿片和氧自由基等通过相应的膜受体介导活化G蛋白，激活磷脂酶C，使膜

IP的最终效应因子可能包括细磷脂降解生成二酰基甘油（DG），DG激活PKC，最后使效应器磷酸化（效应器可能是线粒体上的KATP），从而诱导IP的保护机制。

2 IP的起效时限

在对心肌的IP研究中，根据IP产生保护作用的时间可将其分为两类:早期（或经典）IP［1，10－11］和延迟期（或晚期）IP，后者又称为第2窗保护（second window of protection，SWOP）。早期IP从缺血－再灌注开始几分钟后持续2～3 h，效应较强［17］；延迟期IP则在缺血－再灌注开始的12～24 h后出现，持续3～4 d，持续时间较长，但效应强度不如早期IP。延迟期IP不仅能够对抗细胞梗死，还能够对抗细胞的功能障碍。在心肌，这两种类型的IP都存在，但在某些其他器官，如脑中只存在延迟期IP。

虽然在作用机制上，早期和延迟期IP可能存在潜在的差别，但两者的病理生理学基础是相同的［2］。PKC无论在早期还是延迟期IP中都起着主要调节作 用。NF－k B 介 导 的 JAK－STAT 通 路［12］和c AMP－PKA通路［2］与两种类型IP 都有关联，KATP通道的开放在延迟期IP中起着触发器和/（或）信号传导因子的双重作用；但在触发、信号传导和作用于效应器的具体过程中，各因子在早期或延迟期IP中所起作用的重要程度可能存在差别［2］。

3 IP的实施方案

除了对靶器官直接实施IP产生局部的保护作用以外，1993年，Przyklenk等［13］发现对冠状动脉回旋支施行反复短暂IP后，未经处理的左前降支在持续冠脉阻断后其心肌梗死范围也明显减小，从而提出了远距缺血预处理（remote ischemia preconditioning，RIP）的概念。Cheung等［14］在一个随机对照临床试验中首次报告了RIP的临床应用，该研究用血压表袖套对股动脉每5 min施行缺血－再灌注1次，共4个循环的无创IP，结果显示可以在儿童先天性心脏病体外循环手术中对心肌IRI产生保护作用。

2003年，Zhao等［15］将在体犬心肌冠脉左前降支结扎缺血60 min后，立即给予30 s再灌注 ＋30 s缺血，共3个循环，发现在随后的3 h再灌注后，心肌梗死面积明显减小。这种在缺血后再灌注初期再次予以短暂重复阻断血流和再灌注的处理方式被命名为缺血后处理（ischemic postconditioning，IPo）。此后，Staat等［16］报告IPo可减少患者在冠状动脉血管成形术中再灌注后肌酸激酶的释放，减轻心肌损伤。

IP、RIP和IPo这3种干预方式虽然形式上存在差异，但在启动机体内源性保护机制和效应方面基本类似，后两者在临床上更具有可操作性。

早先在心肌IP的研究中，多采用短暂缺血－再灌注4～6个循环以诱导IP的保护作用，但这种多次循环IP的方案实际应用性较差。近几年来，研究者们普遍采用单次缺血－再灌注方案，对IRI的保护效果与以往多次循环方案类似［2，17－18］。

4 IP对肺IRI的保护作用

相对其他器官而言，对肺的IP的研究报告较少。肺的缺血会引起线粒体内ATP的耗竭，导致细胞膜通透性以及细胞内渗透压的改变，引起细胞骨架和线粒体破坏，甚至引起细胞的凋亡和坏死；随后的再灌注将通过中性粒细胞与失去功能的内皮细胞的相互作用，进一步对肺产生破坏作用包括:氧自由基大量产生，凝血系统被激活，更多的炎症细胞黏附，同时伴有其他类型的组织损伤。由于肺的IRI在包括肺栓塞、创伤、低血容量、内毒素休克、肺移植和一些严重的呼吸疾病中都扮演了非常重要的角色，IP是否同样在肺脏起到保护作用自然也受到了关注。缺乏合适的供体以及由于肺结构的特殊性所带来的供体保存的困难一直困扰着肺移植的发展。如果IP能保护移植肺的IRI并能应用于临床，它将对供体保存起到积极作用。

已有一些动物试验发现了IP对肺IRI的保护作用。Soncul等［19］在猪离体肺灌注模型中，施行2个循环的5 min缺血＋5 min再灌注预处理，热缺血3 h后再灌注30 min，发现可以减轻再灌注阶段肺动脉压上升的程度。Gasparri等［20］在兔肺离体缺血－再灌注模型中，比较了单次5 min缺血＋10 min再灌注预处理和3个循环的5 min缺血＋10 min再灌注预处理或5个循环的3 min缺血＋10 min再灌注预处理的保护效果，认为后两种预处理方式能显著减轻肺水肿程度并改善氧合。Featherstone等［21］在大鼠模型中发现单纯阻断肺通气作为预处理方法也同样可以取得与传统的同时阻断两侧肺血流和通气的预处理相似的结果。

一般认为，应该在最终引起损伤的缺血－再灌注前即进行预处理，但对预处理持续时间及次数仍存在争议，上述Gasparri等［20］在兔肺模型中得出的结论认为15 min的IP对肺IRI的保护效果好于5 min的IP。Gasparri等［20］和 Featherstone等［21］均认为重复的IP比单次IP的结果略好。然而，Friedrich等［22］在兔肺模型中得出了相反的结论，认为5 min的IP的保护效果好于10 min。Yildiz等［22］对离体鼠肺实施单次5 min的IP，与腺苷预处理比较，两组都能够显著降低肺血管阻力，减轻肺水肿。徐松涛等［18］报告单次5 min缺血＋10 min再灌注的IP方案，对热缺血1 h的无心跳供体大鼠移植肺IRI有较强的早期保护效应，这种保护效应与线粒体ATP敏感的钾通道开放有关。

一些有关RIP的研究同样发现了对肺的保护作用。Olguner等［24］报告了对鼠下肢施行IP可以减轻肺水肿程度和脂质过氧化反应。Huda等［25］发现对肠系膜动脉实施IP，可以调控基因表达，减轻肺损伤程度。Tamion等［26］得出了相似的结论，并进一步阐明通过选择性地上调肠HO－1 mRNA可以降低肺ICAM和TNF水平。

IP对肺的保护机制可能包括:对细胞因子TNF－α、IL－6和IL－8等的抑制，进而减少中性粒细胞活化和浸润；减少脂质过氧化反应；通过上调bcl－2蛋白的表达减少在体肺细胞的凋亡；增加内源性降钙素基因相关多肽（CGRP）的产生；减少氧自由基的产生。IP可以减少肺缺血－再灌注中出现的中性粒细胞、TXB2、丙二醛的增多，增加超氧化物歧化酶（SOD）和CGRP的产生，保护肺功能，提高动脉血氧分压，降低肺动脉压力和血管阻力，减少肺组织的损伤。腺苷、NO等参与了肺IP反应的启动过程和信号传递，K－ATP同样在肺IP中起着终末效应器的作用。

IP真正用于临床的报告仍然很少［2］，但它对于临床工作中肺IRI保护、尤其是肺移植中供肺的保护具有潜在的重要价值。

［1］Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）:1124－1136.

［2］Ambros JT，Herrero－Fresneda I，Borau OG，et al.Ischemic preconditioning in solid organ transplantation:from experimental to clinics［J］.Transpl Int，2007，20（3）:219－229.

［3］Lai IR，Chang KJ，Chen CF，et al.Transient limb ischemia induces remote preconditioning in liver among rats:the protective role of heme oxygenase－1［J］，Transplantation，2006，81（9）:1311－1317.

［4］Liu GS，Thornton J，Van Winkle DM.Protection against infarction afforded by preconditioning is meditated by A1 adenosine receptors in rabbit heart［J］.Circulation，1991，84（1）:350－356.

［5］Kloner BA.Does ischemic preconditioning occur in patients［J］.JACC，1994，24（4）:1133－1142.

［6］Schultz JEJ，Hsu AK，Gross GJ.Morphine mimics the car－dioprotective effect ischemic preconditioning via a glibenclamide－sensitive mechanism in rat heart［J］.Circ Res.1996，78（6）:1100－1104.

［7］Nishida M，Maruyama Y，Tanaka R，et al.G alpha（i）and G alpha（o），target proteins of reactive oxygen species［J］.Nature，2000，408（6811）:492－495.

［8］Ping P，Zhang J，Zheng YT，et al.Demonstration of selective，PKC－dependent activation of Src and Lck tyrosine kinases during ischemic preconditioning in conscious rabbits［J］.Circ Res，1999，85（6）:542－550.

［9］Hausenloy DJ，Yellon DM.Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）:240－253.

［10］Kloner RA，Bolli R，Marban E，et al.Medical and cellular implications of stunning，hibernation and preconditioning:an NHLBI workshop［J］.Circulation，1998，97（18）:1848－1867.

［11］Kuzuya T，Hoshida S，Yamashita N，et al.Delayed effects of sublethal ischemia on the acquisition of tolerance to ischemia［J］.Circ Res，1993，72:1293－1299.

［12］Bolli R，Dawn B，Xuan YT.Role of the JAK－STAT pathway in protection against myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Trends Cardiovasc Med，2003，13（2）:72－79.

［13］Przyklenk K，Bauer B，Ovize M，et al.Regional ischemic‘preconditioning’protects remote virgin myocardium from subsequent sustained coronary occlusion［J］.Circulation，1993，87（3）:893－899.

［14］Cheung MM，Kharbanda RK，Konstantinov IE，et al.Randomized controlled trial of the effects of remote ischemic preconditioning on children undergoing cardiac surgery:first clinical application in humans［J］.J Am Coll Cardiol，2006，47（11）:2277－2282.

［15］Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol（Heart Circ Physiol）.2003，285（2）:579－588.

［16］Staat P，Rioufol G，Piot C，et al.Postconditioning the human heart［J］.Circulation，2005，112（14）:2143－2148.

［17］Torras J，Herrero－Fresneda I，Lloberas N，et al.Promising effects of ischemic preconditioning in renal transplantation［J］.Kidney Int，2002，61（6）:2218－2227.

［18］徐松涛，郭卫刚，谭黎杰，等.缺血预处理对无心跳供体大鼠移植肺缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国临床医学，2010，17（1）:22－25.

［19］Soncul H，Oz E，Kalaycioglu S.Role of ischemic preconditioning on ischemia－reperfusion injury of the lung［J］.Chest，1999，115（6）:1672－1677.

［20］Gasparri RI，Jannis NC，Flameng WJ，et al.Ischemic preconditioning enhances donor lung preservation in the rabbit［J］.Eur J Cardiothorac Surg，1999，16（6）:639－646.

［21］Featherstone RL，Chambers DJ，Kelly FJ.Ischemic preconditioning enhances recovery of isolated rat lungs after hypothermic preservation［J］.Ann Thorac Surg，2000，69（1）:237－242.

［22］Friedrich I，Spillner J，Lu EX，et al.Ischemic pre－conditioning of 5 min but not 10 min improves lung function after warm ischemia in a canine model［J］.J Heart Lung Transplant，2001，20（9）:985－995.

［23］Yildiz G，Demiryürek AT，Gümüel B，et al.Ischemic preconditioning modulates ischemia－reperfusion injury in the rat lung:role of adenosine receptors［J］.Eur J Pharmacol，2007，556（1－3）:144－150.

［24］Olguner C，Koca U，Kar A，et al.Ischemic preconditioning attenuates the lipid peroxidation and remote lung injury in the rat model of unilateral lower limb ischemia reperfusion［J］.Acta Anaesthesiol Scand.2006，50（2）:150－155.

［25］Huda R，Chung DH，Mathru M.Ischemic preconditioning at a distance:altered gene expression in mouse heart and other organs following brief occlusion of the mesenteric artery［J］.Heart Lung Circ，2005，14（1）:36－43.

［26］Tamion F，Richard V，Renet S，et al.Intestinal preconditionning prevents inflammatory response by moduling hemeoxygenase－1 expression in endotoxic shock model［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，193（6）:1308－1314.

Protective Effects of Ischemia Preconditioning on Lung Ischemia－Reperfusion Injury

XU Songtao Depart－

ment of Thoracic Surgery，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China

R654.1

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