耐高温的结核分枝杆菌二株

吴龙章 蔡杏珊 谭耀驹 杨建良 刘燕文 钟炳棠 陈剑锋

耐高温的结核分枝杆菌二株

吴龙章 蔡杏珊 谭耀驹 杨建良 刘燕文 钟炳棠 陈剑锋

分枝杆菌菌型鉴定在结核病流行病学调研和临床用药指导方面起到了至关重要的作用［1］，因由 Mtb或非结核分枝杆菌（non－tuberculosis Mycobacteria，NTM）引致的肺部疾病，其临床症状和X线影像表现没有任何的区别，但临床治疗有很大的差异甚至完全不同［2］，因此结核分枝杆菌复合群（MTC）与NTM正确的区分尤为重要。故中国防痨协会基础专业委员会在1995年制定并于2006年再版修订了《结核病诊断实验室检验规程》（简称“规程”）［3］，其中分枝杆菌的鉴定程序为结核病流行病学调研和指导临床用药方面提供了可靠的业务保障。在规程中，对MTC的鉴定有明确的实验室鉴定标准，如生长速度缓慢，不产色性，对硝基苯甲酸（PNB）、耐热触酶和吐温－80水解试验阴性，噻吩－2－羧酸肼（TCH）、硝酸盐还原试验及尿素酶分解试验阳性，对5%NaCl不耐受等；培养温度宜37℃，在28℃和42℃环境下不生长等。但笔者在对2913株分枝杆菌进行菌型鉴定时，在1736株确诊为MTC株中发现2株（注：来自同一例患者）能在42℃高温环境下生长的株种，现报道如下。

资料和方法

1.患者资料：男性，19岁。“反复咳嗽、咯痰3年”，因症状加重伴发热、气促3月余于2011年7月12日入院。入院体检：体温 （T）36.5 ℃，脉 搏 （P）113 次／min，呼吸 （R）24次／min；白细胞总数（WBC）18.9×109／L，中性粒细胞（N）0.8157；血红蛋白（Hb）101.59g／L；肝肾功能无异常；尿常规示尿蛋白（＋）；X线结果显示双上、中、下肺野均可见结核病灶，并双上、中肺野空洞形成；实验室痰分枝杆菌涂片阳性（＋＋）。

2.仪器和试剂：培养所用的改良罗氏培养基和PNB、TCH、5%NaCl鉴别培养基，以及其他生化反应培养基均按照《规程》配制［3］。确证试验MPB64单克隆抗体［4］购自杭州创新生物检控技术有限公司，DNA微列阵技术序列分析［5］试剂购自北京博奥生物有限公司。

3.检验方法：分别于2011年7月13日和11月9日两次留取晨痰，利用改良罗氏培养基做分枝杆菌培养，实验序号：1111723和1119048。并分别于2011年8月25日和2011年12月30日培养阳性，菌落涂片经抗酸染色确认为分枝杆菌，后同时（2株菌株同时进行同一实验，以下不再标示）按照《规程》进行药物敏感度（药敏）试验和菌型鉴定［3］。以 MPB64单克隆抗体［4］及DNA微列阵技术序列分析［5］试验进行确证。

结 果

1.药敏结果：异烟肼（H）、链霉素（S）、乙胺丁醇（E）、阿米卡星（Am）、克拉霉素（Clr）、左氧氟沙星（Lfx）、莫西沙星（Mfx）、丙硫异烟胺（Pto）及对氨基水杨酸异烟肼（Pa）敏感，对利福平（R）和利福布汀（Rfb）耐药。分枝杆菌初筛试验：PNB阴性，TCH阳性，初步定性分枝杆菌为MTC。

2.菌型鉴定结果：（1）生物化学试验：PNB、28℃和5%NaCl不生长；耐热触酶和吐温－80水解试验阴性；TCH和硝酸盐还原试验，以及尿素酶分解试验阳性；在42℃高温环境下生长，不过其培养基斜面生长的菌落数比对照管（37℃）稍微稀落。（2）确证试验：MPB64单克隆抗体及DNA微列阵技术序列分析试验均确证这2株耐高温株为MTC株种。（3）验证试验：为确保实验结果的可靠性，在进行生物化学鉴定和确证试验的同时，与该例患者的2株菌株一起用H37Rv株作为对照参考试验。

讨 论

分枝杆菌不同菌群的生长发育与培养时的温度关系甚为密切，其中大部分NTM基本能在25～42℃环境中生长［3］；但 MTC对生长温度条件的要求则比较苛刻［6］，宜置35～37℃温度条件下孵育，在30℃以下或40℃以上均不能生长或很难生长；此外MTC在规程中被归类于“结核分枝杆菌菌群”，其与 NTM 在生物特性上有所不同［3］，其中RunyonⅠ、Ⅱ群基本为产色性株种，而RunyonⅣ群为快速生长型；但“结核分枝杆菌菌群”与RunyonⅢ群却有一共同点，为不产色性和生长缓慢型，不同之处是后者基本能在28℃环境下生长，并有部分可在42℃高温环境中裂殖［3］；因此分枝杆菌菌群初筛可利用色源性、生长速度及温差将MTC与NTM两者区别。

在规程中，同样为不产色性和生长缓慢并在42℃高温环境下生长的RunyonⅢ群分枝杆菌群有［3］：鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和施氏分枝杆菌，其中前两者能在28℃环境下裂殖，而后者只在37～42℃环境中生长；本研究中发现的2株耐高温MTC株种生长所需温度环境特性与施氏分枝杆菌一样，同样能在37～42℃环境中生长繁殖，这是MTC极为罕见的生物现象。因此这两者的鉴别试验非常重要。

笔者的体会是：吐温－80水解试验和尿素酶分解试验是其区别的关键！虽然施氏分枝杆菌与绝大部分NTM一样对PNB耐受，但有文献报道［7］：5.21%的 MTC对PNB产生了耐药性；此外施氏分枝杆菌的耐热触酶试验阳性，但对H高度耐药的MTC也呈耐热触酶试验阳性的现象［8］；同时在规程中指出：MTC的硝酸盐还原试验大部分为阳性，可是牛分枝杆菌及部分非洲分枝杆菌与施氏分枝杆菌同样为阴性。因此，一旦出现PNB和耐热触酶试验阳性，以及硝酸盐还原试验阴性但为可疑MTC株种（如菌落为米黄色、形态粗糙呈菜花样，培养物涂片抗酸染色呈典型索条状，以及对一线抗结核药物敏感）者［7，9］，吐温－80水解试验和尿素酶分解试验将是其与施氏分枝杆菌区别的惟一关键实验，因后者吐温－80水解试验阳性而尿素酶分解试验阴性。

作者单位：510095广州市胸科医院呼吸疾病国家重点实验室（结核病研究室）

此外，本研究结果表明：该2株耐高温MTC株仅对R和Rfb耐药，而对临床上其他使用的常规抗结核药物敏感，因而菌株的耐高温特性与药物耐药与否没有因果关系；同时患者在入院前后有低热而未见39℃或以上的高体温现象，从而也表明该2株耐高温MTC株未曾有在39℃或以上高温环境下生存过的条件，因而菌株的耐高温特性也似乎与此没有因果关系。

综合上述分析，笔者认为：该2株菌株经生物化学试验和确证试验后完全符合“结核分枝杆菌菌群”的所有特征，但其能在42℃高温环境下生长，这与典型的“结核分枝杆菌菌群”又有着巨大的差异，且在同一患者同时分离出2株能耐高温的Mtb株种，笔者检索了有关资料（根据万方医学网和中国知网等中文数据库检索），未见有关类似的报道。这是否提示Mtb群序列排列有所改变？是今后值得我们研究的课题。

［1］吴龙章，陈素颖，曾少芳，等.广州市12年间分枝杆菌菌型与药物敏感性结果变迁的分析.中华预防医学杂志，2011，45（1）：26－29.

［2］吴龙章，蔡杏珊，关玉华，等.66例非结核分支杆菌肺病的临床分析.中国防痨杂志，2003，25（4）：257－259.

［3］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京：中国教育文化出版社，2006：30－96.

［4］顾欣荣，陈俊林，顾德林，等.MPB64抗原检测对分枝杆菌菌型快速鉴别的价值探讨.江苏预防医学，2009，20（3）：34－35.

［5］刘晶波，乐军，韩敏，等.应用微列阵技术快速鉴定常见致病性分枝杆菌.中华临床感染病杂志，2010，3（1）：44－47.

［6］郭钧，孟昭赫.结核病细菌学.沈阳：辽宁科学技术出版社，1983：23－28.

［7］吴龙章，潘美玉，刘欣，等.结核分枝杆菌对对硝基苯甲酸耐药性的研究.中华结核和呼吸杂志，2011，34（2）：117－119.

［8］吴龙章，钟炳棠，刘燕文，等.对《结核病诊断细菌学检验规程》的一点看法.中国防痨杂志，2012，34（3）：192－193.

［9］吴龙章，蔡杏珊，谭守勇.试管内药物抑制分支杆菌生长的观察.广东医学，2001，22（6）：512－513.

2012－05－18）

（本文编辑：张晓进）

广东省科技厅（2012A030400035）；广州市医药卫生科技项目（20121A011082）