海洋动物寡肽制备与功能特性研究进展

李 荣，郁 迪，杨最素，王加斌，李 丽，丁国芳

（1.浙江海洋学院食品与药学学院，浙江省海洋生物医用制品重点工程技术研究中心，浙江舟山 316004；2.浙江海力生集团有限公司，浙江舟山 316021；3.浙江国际海运职业技术学院，浙江舟山 316021）

寡肽（Oligo-peptide）是由2～10个氨基酸组合而成的蛋白质前体，或是由蛋白质降解到2～10个氨基酸形成的一种低分子量生物活性肽，也称小肽、短肽等。独特的氨基酸组成，使寡肽可直接被人体完整的吸收，且比氨基酸更容易消化吸收，营养和生理效果也更为优越[1]。我国海洋生物资源丰富，海洋动物种类繁多，其中大部分蕴含丰富的蛋白质及肽，由于海洋动物处于高盐、高压、低温缺氧、光照不足等特殊的生活环境中，使得来源于海洋动物的蛋白质和肽具有独特的生物活性。如今，已有研究表明海洋动物寡肽具有抗氧化，抗肿瘤，抗高血压，降血糖，增强机体免疫力等活性，并已被广泛应用于医药，功能食品，化妆品等多个领域。本文主要根据海洋动物寡肽的来源将其分为几大类，并对各类寡肽的制备方法及其生物活性进行综述。

1 鱼类

鱼类是人们最早食用的海洋动物之一，营养价值极高，体内含有丰富的蛋白质。RIM等[2]在虾虎鱼肌肉蛋白酶解物中利用Sephadex G-25和RP-HPLC等实验技术分离出几种具有抗凝血作用的小肽，这些小肽具有延长凝血酶时间和活化部分凝血酶时间的作用，氨基酸序列分别为：Leu-Cys-Arg，His-Cys-Phe，Cys-Leu-Cys-Arg和Leu-Cys-Arg-Arg。已有研究表明在长喙鲑鱼Hypoptychus Dybowskii[3]、太平洋鳕鱼Merluccius productus[4]、红鲷鱼Lutjanus vitta[5]及金枪鱼[6]的肉组织蛋白酶解物中也分离得到强抗氧化活性短肽。说明这些海洋鱼类蛋白酶解得到的寡肽是很好的天然抗氧化物的来源。

在海洋食品工厂化生产中会产生大量的下脚料如鱼虾类内脏等，经研究发现这些下脚料中含有大量活性物质，根据其活性进一步开发利用，可提高下脚料的经济价值。ALI等[7]利用沙丁鱼Sardinella aurita的头及内脏等废弃物作为实验原料，采用酶解法进行提取，通过Sephadex G-25和RP-HPLC进一步分离纯化后得到七种新型抗氧化活性寡肽其氨基酸结构分别为Leu-His-Tyr、Leu-Ala-Arg-Leu、Gly-Gly-Glu、Gly-Ala-His、Gly-Ala-Trp-Ala、Pro-His-Tyr-Leu 和 Gly-Ala-Leu-Ala-Ala-His。DPPH 自由基清除实验，抑制亚油酸自氧化实验及还原力测试表明这些活性肽有较强的抗氧化活性，其中Leu-His-Tyr的自由基清除能力最强，在150 μg/mL时对DPPH自由基的清除率可达到63%±1.5%。KUMAR等[8]在体外模拟胃肠的消化作用，对竹荚鱼Magalaspis cordyla内脏进行处理得到其蛋白水解物，再利用FPLC，DEAE阴离子交换技术，Sephadex G-25等方法对样品进行分离纯化，最终得到一种具有强抗氧化活性的寡肽，经ESI-MS/MS分析确定其氨基酸序列为：Ala-Cys-Phe-Leu(518.5 Da),抗氧化活性测定结果表明该活性肽对DPPH和羟自由基的清除率分别可达到89.2%和59.1%，并且抑制多不饱和脂肪酸氧化的能力要强于天然抗氧化剂 α-tocopherol。

胶原蛋白(Collagen)又称胶原，是真皮的主要组成成分。由于胶原蛋白分子是由3条多肽链构成3股螺旋结构的蛋白质，能维持皮肤张力和弹性，和周围组织的亲合性好，具有修复组织的作用，且分子中含有大量的酰胺基团和羟基，具有较强的吸湿性，从而使皮肤保持饱满充盈[9]。杨国艳等[10]对胶原三肽的抗氧化活性进行了研究，并与普通胶原蛋白肽进行了比较，发现不论是在体外实验中对DPPH自由基、螯合Fe2+的清除能力还是小鼠体内实验中提高SOD活力，降低MDA含量的能力，胶原三肽均优于普通胶原蛋白肽。在鱼皮和鱼鳔中含有大量胶原蛋白，利用酶解法等对这些胶原蛋白处理可得到更易于人体吸收的胶原蛋白肽。贾建萍等[11]对三文鱼Oncorhynchus keta皮胶原蛋白肽的制备及其抗氧化活性进行了研究，经过提取分离纯化得到了不同分子量区间的活性肽，发现当分子量在180～1 000 Da的活性肽含量越高时，抗氧化活性越好。ZHU等[12]对鲑鱼Salmo salar皮寡肽作用于二型糖尿病大鼠模型所产生的功效进行了研究，发现鲑鱼皮寡肽作用于大鼠模型后可减少其体内FBG水平和胰岛细胞的凋亡频率，降低大鼠胰岛中Fas的表达，并且使大鼠血清中TNFα，IFNγ和MDA的水平显著降低。段振华等[13]对超声波辅助鱼鳔寡肽制备工艺进行研究，发现超声波处理30 min可以最大程度地促进鱼鳔蛋白的水解，解效果在固液比1:35时最好，正交试验确定鱼鳔蛋白最佳酶解条件为温度55℃，pH值6.0，酶量0.8%，反应时间7 h，此时的平均肽链长度约为5.6，表明实验所得的胶原蛋白肽为寡肽。韩凤杰等[14]采用酶解法在比目鱼Pleuronectiformes皮中提取得到分子量分布在0.6～1.8 kDa的比目鱼皮胶原肽，对其活性测定发现比目鱼皮胶原寡肽对血管紧张素转化酶(ACE)有明显的抑制作用，IC50可达1.65 mg/mL。且分子量越小的组分的抑制效果越好。小鼠动物试验还表明无论内服或外用，该胶原蛋白寡肽均能促进皮肤内胶原的合成，表明可起到美容和保健的功能。

2 鲨鱼

国内外学者已对鲨鱼进行了较广泛的研究，其中包括对鲨鱼中活性肽的大量研究。吕正兵等[15]从鲨鱼肝脏中首次分离纯化获得了鲨肝活性肽(shark hepatic active peptide，SHAP)，并用流式细胞仪分析了SHAP对乙酰氨基酚诱导的肝损伤模型小鼠细胞凋亡的影响。实验显示以3 mg/kg SHAP进行保护可使细胞凋亡率下降至3.24%±1.62%。表明肝鲨活性肽具有保护肝细胞的生理活性。黄凤杰等[16]发现鲨鱼肝活性肽S28300对链佐霉素和四氧嘧啶所致的血糖升高有显著的抑制作用，这表明鲨鱼肝活性肽S28300可能具有减弱STZ对胰岛β细胞的杀伤作用或改善损伤的胰岛β细胞的功能。谢宗法等[17]采用现代生物技术从幼年鲨鱼肝脏中提取出一组小分子多肽物质，经研究发现其能有效促进成纤维细胞等多种组织细胞的增殖分化,提高人淋巴细胞形成Ea花环的能力，诱导PBMC产生IFN-γ，增强NK细胞活性，对淋巴细胞表面HLADR抗原的表达也显示出良好的正向调节作用。WU等[18]从芽孢杆菌中提取蛋白酶SM98011，用其水解鲨鱼肉后纯化得到7个具有高效抑制ACE的2肽，它们的氨基酸序列分别为：Cys-Phe、Glu-Tyr、Met-Phe、Phe-Glu、Cys-Phe、Glu-Tyr和 Phe-Glu。

3 头足类动物

头足类动物(如乌贼、鱿鱼、章鱼)中含有许多肽类活性物质。其神经末梢含有肽能激素，如软体动物心肌肽FMPF、利钠肽免疫反应物质。IWAKOSHI等[19]从日本章鱼Octopus minor脑提取液中得到2个活性寡肽Ocp-1:Gly-d-Phe-Gly-Asp和Ocp-3：Gly-Ser-Trp-Asp，并证明它们作为神经肽/神经激素参与心血管系统的刺激性调控。RAJAPAKSE等[20]利用超滤法在大王乌贼Dosidicus gigas肌肉蛋白中分离得到小分子量的肽，研究发现其中氨基酸序列为Asn-Gly-Leu-Glu-Gly-Leu-Lys(747 Da)的小肽具有强抗氧化活性，对亚油酸氧化反应有明显抑制作用，且抗氧化能力与人工合成抗氧化剂丁羟甲苯的活性相当，在电子自旋捕捉的研究中发现，这种活性肽对羟自由基的IC50为428.54 μM；对超氧自由基的IC50为573.83 μM。PAVLINA等[21]利用超滤，RP-HPLC等实验手段，在红螺Rapana venosa血淋巴中分离出11种分子量在3 000～9 500 Da的新型富含脯氨酸的小肽，经研究发现其中4种小肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有较高的抑菌活性。丁国芳等[22]从乌贼墨中通过酶解得到一种寡肽，其具有明显的抗肿瘤作用。谢超等[23]对鱿鱼肝脏蛋白酶解物进行提取分离得到一种ACE抑制肽，抑制活性最高组分的IC50为1.80 mg/mL，这种具有高ACE抑制活性的抑制肽可进一步研究并将其开发为相关药物或功能食品。

4 贝类

贝类，属软体动物门中的瓣鳃纲，常见的牡蛎、贻贝、蛤、蛏等都属此类。

WANG等[24]利用葡聚糖凝胶LH-20和RP-HPLC等试验方法对牡蛎Crassostrea talienwhanensis酶解物进行分离纯化，得到具有ACE抑制活性的九肽，其氨基酸序列为Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe。自发性高血压小鼠体内实验表明，该活性肽具有良好的抗高血压活性。杨永芳[25]等利用酶解等方法在菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum中提取得到分子量为607.6 kDa，氨基酸序列为：Asp-Trp-Pro-His的抗氧话活性寡肽。经研究发现在在栉孔扇贝[26]、扇贝Chlamys farreri裙边[27]，牡蛎Ostrea rivularis[28]、文蛤[29]的酶解液中也都提取得到分子量小于1 000 Da的抗氧化活性肽。杨永芳等[30]在贻贝Mytilus coruscus水解液中分离出一种氨基酸序列为Asp-Leu-Tyr的寡肽，并利用MTT法，免疫组化法，及流式细胞仪检测等实验方法检测该寡肽的体外抗肿瘤活性，结果表明该寡肽具有良好的抗肿瘤活性。

高F值寡肽是一类由3～7个氨基酸残基组成的混合小肽体系，含有高支链氨基酸和低芳香族氨基酸的特殊生物活性肽，具有辅助治疗肝性脑病、改善肝昏迷程度和精神状态的功能，对于酒精、药物等引起的急慢性肝损伤也起到了积极的保肝护肝作用[31]。周敏华等[32]利用活性碳吸附法对牡蛎Ostrea rivularis酶解液进行吸附分离，酶解产物采用活性碳吸附后，再经过Biogel P2凝胶层析进行进一步的分离纯化，得到相对分子质量约800～1 450，F值大于20的高F值寡肽混合物。郑惠娜等[33]对马氏珠贝母Pinctada martensii高F值寡肽的抗氧化作用进行了研究，发现其对羟自由基、DPPH自由基及超氧阴离子均有一定的清除能力。并且发现其对H2O2诱导的LO2肝细胞损伤有保护作用。

5 海绵

海绵(Sponge)是最低等的多细胞动物，结构较简单,但含有极为丰富的生理活性物质。Euryjanicin A是从加勒比海海绵Prosuberites laughlini中分离得到的一种新型环状庚肽。通过X射线晶体学确定其结构并利用Marfey的方法确定每个氨基酸残基的绝对构型。体外实验证明其具有抗肿瘤活性[34]。Hemiasterlin最初是由Kashman's小组从南非海域的海绵(hemiasterlin minor)中提取分离的一种具有高修饰的氨基酸三肽分子的天然产物，随后又在海绵(Cymbastela sp、Siphonchalina spp、Auletta sp)中也提取到此化合物。研究发现它能结合长春碱属作用的微管位点,破坏正常微管的动力学，从而解聚微管，是强有力的抗肿瘤剂[35]。PETTIT[36]从海绵Phakellia sp中分离到的新型环七肽Phakellistatin14具有抑制肿瘤细胞生长的活性，其对小鼠的淋巴癌细胞P388的ED50为5 mg/mL。易杨华等[37]从棕色扁海绵Phakellia fusca Thiele的乙醇提取物中获得1个新的Phakellistatins类环肽化合物，为1个环状七肽(Pro1-Gly-Phe-Pro2-Trp-Leu-Thr)，该化合物具有抗肿瘤活性，这些活性成分为今后药用资源的开发和新药研究奠定了基础。

6 刺胞动物

霞水母学名Cyanea，属刺胞动物门，钵水母纲。林丹等[38]对霞水母胶原蛋白活性肽和寡肽胶原的抗疲劳作用进行了研究。小鼠负重游泳试验、血清尿素氮、肝糖原及血乳酸含量测定表明两种受试物各剂量组小鼠的游泳时间明显长于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，运动后血清尿素氮含量及乳酸曲线下面积均低于对照组(P＜0.01)，游泳后肝糖原含量和空白对照组比较均有不同程度的提高。表明霞水母胶原蛋白活性肽和寡肽胶原均能改善机体能量代谢，加速肝糖原分解供能，减少蛋白质和含氮化合物分解，从而降低血尿素氮，具有抗疲劳作用。

7 节肢动物

吕传萍等[39]对南极磷虾酶解寡肽提取工艺进行研究，发现当提取条件为：温度50.7℃、pH 8.01、加酶量3 010 U/g、时间239 min时，南极磷虾肽的得率最高，为73.02%，短肽的平均肽链长为2.36，平均相对分子量为277.9。范建凤等[40]酶解梭子蟹下脚料并分离纯化得到不同分子量组分的活性肽，发现分子量在1 000 Da左右的活性肽抗氧化活性最好。谢海伟等[41]对鲎中提取的抗菌肽的稳定性进行研究，发现其在120℃、pH小于11.30时，对大肠杆菌K88的MIC为1.52～5.00 mg/L表明，该抗菌肽具有较强的高温耐受性，并发现其对胃蛋白酶有较高的稳定性。

8 结语

我国海洋动物资源丰富，种类繁多，蕴含着大量的活性物质。目前，已有研究表明海洋动物寡肽拥有多种显著生物活性，如强抗氧化活性，抗肿瘤活性等，将这些具有显著生物活性的物质开发为相关保健食品与药品已成为研究新热点，这对海洋活性物质的今后研究开发起到了良好的推进作用。

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