超声波辅助提取羊栖菜岩藻黄质的工艺优化

刘丽平，奚歆儿，汪财生，李彩燕，钱国英

(1.浙江理工大学 生命科学学院，浙江杭州 310018;2.浙江万里学院 生物与环境学院，浙江宁波 315100)

岩藻黄质 (fucoxanthin)又称岩藻黄素、褐藻黄素，属于类胡萝卜素中的叶黄素类，广泛存在于各种藻类、海洋浮游植物、水生贝壳类等动植物中［1-2］，其结构式见图1。国内外有关研究证明，岩藻黄质具有抗氧化、抗癌，增加小鼠体内的DHA和ARA含量等功能［3-5］。岩藻黄质作为药物、保健品及护肤美容产品将具有广阔的应用前景。目前，国内外关于岩藻黄质的研究多取材于海带和裙带菜，而以羊栖菜为材料提取岩藻黄质鲜有报道。

近年来，岩藻黄质的提取多采用溶剂浸提法［6-11］，其次是超临界 CO2萃取法［12-13］。超声波辅助提取岩藻黄质研究甚少［14］。因此，本研究选取羊栖菜为原料，采用响应面法优化超声波辅助乙醇和丙酮混合溶剂提取岩藻黄质的工艺条件，探讨羊栖菜中岩藻黄质的提取率，为提高其经济附价值、工业化生产岩藻黄质产品提供理论及技术参考。

图1 Fucoxanthin结构式

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊栖菜购于浙江温州洞头县5-6月新鲜藻体，清水冲洗藻体表面泥沙、盐粒，沥干后于-20℃冰柜中储藏。实验前取冰冻藻体真空冷冻干燥，粉碎过60目筛于-20℃冰箱中避光密封保存备用。

ALPHA1-4/2-4LSC型冷冻干燥机 (德国Christ)，FW100高速万能粉碎机 (天津泰斯特)，Agilent-1100型高效液相色谱仪 (美国 Agilent)，YJ96-ⅡN超声波细胞粉碎机 (宁波甬杰)，岩藻黄质标准品 (Sigma公司，020M1541)，甲醇、乙腈(色谱纯)，其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 羊栖菜岩藻黄质提取基础工艺

称取10 g羊栖菜干粉于烧杯中，加入一定体积的乙醇和丙酮3∶1(V/V)混合溶液浸提2 h后，置于超声波细胞粉碎机中辅助提取，控制温度65℃［11］，将提取液在4℃冷冻离心机中5 000 r·min-1离心5 min，上清液置于真空旋转蒸发仪中0.1 Mpa避光浓缩，回收溶剂后，冷冻干燥得岩藻黄质粗品。

1.2.2 超声波辅助提取单因素试验

根据1.2.1的提取工艺流程，分别称取一定量的羊栖菜粉末，在不同超声时间 (5，10，15，20，25 min)、超声功率 (200，300，400，500，600 W) 和 液 料 比 (20，30，40，50，60 mL·g-1)的条件下进行单因素试验，考察超声波辅助提取主要因素对岩藻黄质提取率的影响，重复3次，取平均值。

1.2.3 响应面法优化试验设计

为了在现有实验的基础上寻找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，根据单因素试验结果，按1.2.1工艺流程，以羊栖菜岩藻黄质提取率为响应值，超声时间、超声功率和料液比3个因素为自变量，采用Box-Behnken中心组合设计3因素3水平17个试验点的响应面分析试验，考察不同因素及其交互作用对羊栖菜岩藻黄质提取率的影响，借助试验设计软件Design Expert(version 7.0.0)对结果进行分析，以确定最佳提取工艺参数组合，并对试验结果进行验证。因素水平编码见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平及其编码

1.2.4 岩藻黄质含量及提取率分析

岩藻黄质含量的检测参考尹尚军等［11］的HPLC方法，配制 1，2，4，8，16，32，64，128μg·mL-1系列浓度的岩藻黄质标准溶液，于液相色谱D450nm下检测分析，得回归方程。将提取岩藻黄质的上清液定容至一定体积，取样进行HPLC分析。

岩藻黄质提取率/mg·g-1=m1/M，

粗品得率/%=m2/M×100，

纯度/%=(m1/1 000)/m2×100。

m1为样品溶液中岩藻黄质含量 (mg)，m2为样品溶液经真空浓缩干燥得粗品质量 (g)，M为样品溶液中羊栖菜干粉质量 (g)。

2 结果与分析

2.1 检测岩藻黄质含量回归方程的建立

按照1.2.4的方法得回归方程Y=170.39X+13.341(R2=0.999 6)，表明岩藻黄质在1～128 μg·mL-1范围内与峰面积呈现良好的线性关系，可用来检测样品岩藻黄质含量。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声时间对岩藻黄质提取率的影响

采用单因素试验设计，在超声功率300 W，液料比30 mL·g-1的条件下，研究不同提取时间对岩藻黄质提取率的影响。由图2可知，随着样品超声时间的延长，羊栖菜中岩藻黄质提取率增高趋缓，20 min时达到峰值 (1.007 mg·g-1)，之后提取率呈现降低趋势。可能是由于岩藻黄质主要存在于细胞间和细胞壁中，超声时间处理太短不足以破碎细胞，释放色素;时间太长，则超声波的机械剪切力对岩藻黄质有一定的降解和破坏作用，使岩藻黄质含量降低。该结果与赵鹏［14］对海带中岩藻黄质提取的超声时间试验比较，提取率趋势一致，但其超声最佳时间在60 min时，这可能与不同海藻材料细胞壁的致密性不一致有关，造成超声处理时间有一定区别。

图2 超声时间对岩藻黄质提取率的影响

2.2.2 超声功率对超声波辅助提取羊栖菜岩藻黄质提取率的影响

采用单因素试验设计，在超声时间10 min，液料比30 mL·g-1的条件下，研究不同提取功率对岩藻黄质提取率的影响 (图3)。随着超声功率加大，热效应增强，岩藻黄质提取率随之明显增高，至500 W时提取率达到峰值 (1.008 mg·g-1)，此时强烈的空化作用瞬间造成细胞壁破碎加速羊栖菜各种色素有效成分的溶出、扩散。随后超声功率提高至600 W时，岩藻黄质提取率下降为0.876 mg·g-1，表明应用超声波提取该色素，超声强度和空化作用的影响有一定的范围，即超声功率在200～500 W范围内岩藻黄质较稳定。试验表明，功率选择500 W左右时，羊栖菜岩藻黄质的溶出可能达到饱和。

图3 超声功率对岩藻黄质提取率的影响

2.2.3 液料比对超声波辅助提取羊栖菜岩藻黄质的影响

采用单因素试验设计，在超声功率500 W，超声时间10 min的条件下，研究不同液料比对岩藻黄质提取率的影响，结果如图4所示。随液料比的增大，岩藻黄质提取率越高，当液料比为40 mL·g-1时达1.001 mg·g-1，之后岩藻黄质提取率增大幅度减小，几乎不再变化。说明液料比达到一定值时溶剂将岩藻黄质几乎完全溶出。再增大液料比，岩藻黄质的提取率也不会明显增大。一般来说，增加溶剂的比例有利于传质扩散，但在实际操作中溶剂体积过大，会增加生产成本，不利于后续的浓缩，并影响超声波在介质中传递的有效范围减小。因此，提取羊栖菜岩藻黄质时，液料比应考虑40 mL·g-1左右为宜。

图4 液料比对岩藻黄质提取率的影响

2.3 响应曲面试验结果及方程的建立

应用响应曲面法优化提取条件的试验结果如表2所示。

表2 Box-Behnken设计及其实验结果

由响应曲面模型的方差分析表 (表3)可见，所建立的模型因素水平极显著 (P＜0.01)，失拟值为0.075 8(P＞0.05)，表明由误差引起的失拟不显著。模型确定系数值为0.963 1，说明模型可以解释96.31%试验所得岩藻黄质提取率的变化，表明方程拟合较好。校正确定系数为0.915 7，表明岩藻黄质提取率91.57%的变异分布在方程的9个因子中，其总变异中仅有8.43%不能由该模型解释。表明该模型方程因变量与全体自变量间线性关系明显，模型的变异系数值为4.22%，说明模型精密度较好。综合以上各参数表明该实验方法可靠，各因素水平间设计合理，模型方程能较好地反映羊栖菜岩藻黄质提取率与超声时间、超声功率及液料比之间的变化规律关系。因此可用该回归模型预测羊栖菜岩藻黄质提取率的结果。

表3 回归模型的方差分析

表3中模型的方差分析表显示，模型一次项A、B及二次项A、B及交互项AC对岩藻黄质提取率线性和曲面效应影响极显著 (P﹤0.01)，一次项C和二次项C影响显著 (P﹤0.05)，交互项AB和 BC影响不显著 (P﹥0.05)。通过 Design Expert 7.0.0软件对表2的试验数据进行二次多项回归拟合，为了使方程具有更好的拟合性，把一些统计分析不显著 (P﹥0.05)项 (包括AB和BC)从方程中除去，得到优化的二次回归方程如下:

Y=1.184+0.072A+0.086B-0.043C+0.082AC-0.102A2-0.164B2-0.073C2。

其中，Y为岩藻黄质提取率的预测值，A、B、C分别为影响岩藻黄质提取的超声时间、超声功率及液料比的编码值。方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对岩藻黄质提取率的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。

2.4 响应曲面分析及工艺条件的确定和验证

图5-7直观地反映了各因素对岩藻黄质提取率的影响。

各因素间响应曲面图开口向下，随着每个因素水平的增大，响应值增大;响应值达极值后，随着每个因素水平的增大，响应值减小。其中，超声功率对岩藻黄质提取率影响最大，其次是超声时间，且超声时间和液料比间交互作用对岩藻黄质提取率的影响最显著。

图5 超声时间和超声功率对岩藻黄质提取率的影响

图6 超声时间和液料比对岩藻黄质提取率的影响

通过Design Expert 7.0.0软件分析得出，超声波辅助提取羊栖菜岩藻黄质最佳条件为超声时间21.74 min，超声功率 528.52 W，液料比 39.07 mL·g-1，其理论预测岩藻黄质提取率为 1.211 mg·g-1。考虑实际的可操作性，调整超声时间22 min，超声功率530 W，液料比40 mL·g-1为最佳条件。按此工艺条件进行多次验证得到岩藻黄质的平均提取率为 1.202 mg·g-1，与模型预测值(1.210 57 mg·g-1)较接近，充分反映了响应曲面模型的有效性及其强大的分析能力，可为实际操作提供良好的指导。此条件下，岩藻黄质提取率是尹尚军等［11］报道的溶剂浸提羊栖菜岩藻黄质的约1.2倍，是赵鹏［14］超声波辅助提取海带岩藻黄质的约3.5倍。此外，该优化条件下，岩藻黄质粗品得率可达2.68%，纯度为2.02%。

图7 超声功率和液料比对岩藻黄质提取率的影响

3 小结与展望

响应曲面法优化超声波辅助提取羊栖菜岩藻黄质的最佳工艺条件为:控制超声温度65℃，以乙醇和丙酮3∶1(V/V)为溶剂，超声时间22 min，功率530 W，液料比40 mL·g-1。此条件下，岩藻黄质的提取率1.202 mg·g-1，粗品得率2.68%，纯度2.02%。可见，超声波辅助提取羊栖菜岩藻黄质效果显著高于溶剂浸提法，可为岩藻黄质的工业化生产提供理论参考。并提示羊栖菜中岩藻黄质的含量远比海带丰富，极具开发价值。但关于岩藻黄质的分离纯化尚需进一步研究。

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