高效液相色谱法测定烟草及烟草制品中的三种水溶性糖

黄 菲，黄翼飞

（广东中烟工业有限责任公司技术中心，广州 510145）

烟草中的水溶性糖与烟草的口感、香味特征和焦油生成量关系密切。葡萄糖、果糖和蔗糖是烟草中主要的水溶性糖，是烟草中具有代表性的糖类。

早期主要采用纸色谱法、薄层色谱法及柱层析法等经典方法进行混合糖的分析，这些方法分辨率低、分析时间长、定量测定困难，难以实现自动化操作。

气相色谱法也可用于对糖类物质的分离测定。气相色谱法具有选择性好，灵敏度高等优点。但葡萄糖、果糖和蔗糖等糖的沸点高、挥发性低、难气化，在进行气相色谱分析时，需要将这些糖类物质先衍生为可气化的挥发性成分。但衍生操作步骤繁琐，耗时耗力，而且对衍生化合物的稳定性难以进行直观的评判，这些因素都会影响对糖类物质的准确测定。基于这些不足，现在测定单糖和二糖已较少采用气相色谱法。

对葡萄糖、果糖和蔗糖等糖类的直接测定，高效液相色谱法（HPLC）、离子色谱法（IC）和高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）都有报道，这3种方法分析糖类物质都无需进行柱前衍生化操作。电喷雾离子化技术在高效液相色谱-质谱联用法对糖类物质进行定量时得到广泛的应用。HPLC-MS分析糖灵敏度很高，分析速度较快，非常适合对痕量糖类的定性定量分析。由于烟草和烟草制品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量较高，通常无需使用高灵敏度的HPLC-MS法。离子色谱法也较多的应用在对糖的测定中，离子色谱法测糖也可以达到较低的检测限，适合用于对微量糖类物质的测定。离子色谱法的检测灵敏度也远高于对烟草和烟草制品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量的检测要求，因此进样前需要对样品进行较大倍数的稀释（如稀释 100倍），且离子色谱法包括柱平衡在内的分析时间较长，平均测试一个样品需要1.33 h或以上。高效液相色谱法是目前测糖使用最多的方法[1-6]。高效液相色谱法测糖较离子色谱法简便，测糖稳定性和重复性好，仪器维护简单，仪器普及率更高，检测灵敏度完全满足日常分析的应用要求。

笔者采用以高度交联的铅型磺化苯乙烯-二乙烯苯（SDVB）树脂为填料的阳离子交换色谱柱建立了测定烟草及烟草制品中葡萄糖、果糖和蔗糖的高效液相色谱方法。该方法准确、重复性和再现性好、适用性强。该方法还有一个优点是仅使用无任何污染的超纯水作为流动相即可达到理想的分离效果和得到良好的色谱峰形，无需使用乙腈等有毒有害试剂，达到经济、安全和清洁环保的要求。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

蔗糖、D-(-)-果糖、D-(+)-无水葡萄糖（纯度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司）；乙腈（纯度≥99.9%，MERCK公司）；超纯水。

1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配备G1378B脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱和G1362A示差折光检测器（RID）；Varian Metacarb Pb PLUS色谱柱（300 mm × 7.8 mm）和 Varian Metacarb 87P 预柱柱芯（美国Varian公司）；Milli-Q Element A10 纯水机（美国Millipore公司）；HY-5回旋振荡器（金坛市富华电器有限公司）；CP 224S电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 样品处理与分析

试验于 2009年 3月—2010年 9月进行，取1.0000 g烟末，置于100 mL磨口锥形瓶中，准确加入50 mL 0.01 mol/L NaOH萃取溶液，具塞振荡萃取60 min，经0.45 µm滤膜过滤，滤液进行HPLC分析。分析条件为：Varian Metacarb Pb PLUS色谱柱和Varian Metacarb 87P 预柱柱芯；柱温箱温度：80℃；流动相：水，等梯度洗脱；进样量：20 μL；流速：0.4 mL/min。

2 结 果

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 色谱柱的选择 示差折光检测器较多配合使用氨基丙基硅烷为键合相的硅胶柱（以下简称氨基柱）和阳离子交换色谱柱以及相应的流动相进行水溶性糖类的测定。由于某些烟草和烟草制品样品的葡萄糖、果糖和蔗糖含量较低，因此，能达到较低的检测限是色谱柱和流动相选择的一个重要前提。实验选用Waters公司的氨基柱（高效碳水化合物卡套色谱柱，4.6 mm × 250 mm，4 μm）和Varian公司的Varian Metacarb Pb Plus阳离子交换色谱柱对比了分析葡萄糖、果糖和蔗糖的检测灵敏度，结果见表1。其中使用Waters公司氨基柱的优化分析色谱条件[7]为：Sentry高效碳水化合物保护柱和Sentry整合保护柱套（美国Waters公司）；柱温箱温度：35 ℃；RID光学元件温度：35 ℃；流动相：72%（体积分数）乙腈/28%水预混合溶液，等梯度洗脱；进样量：10 μL；流速：1 mL/min。

由表1可见，使用Varian Metacarb Pb Plus阳离子交换色谱柱和水流动相可以达到很低的检测限，比使用高效碳水化合物卡套色谱柱和乙腈-水流动相的检测限低 27倍以上。由于氨基柱在使用的过程中会逐渐流失一些键合在硅胶上的氨基碱性基团，这些持续而不稳定的柱流失造成了较大的基线波动，一般基线波动在120 nRIU范围内（nRIU为示差折光单位的十亿分之一）。这些因素造成了使用高效碳水化合物卡套色谱柱测葡萄糖、果糖和蔗糖的灵敏度较低。且由于氨基柱的持续性柱流失，对糖的分离性能下降较快。随着色谱柱的分离性能下降，对葡萄糖、果糖和蔗糖的保留逐渐减弱，3种糖的色谱峰保留时间会逐渐减少，以至于果糖和葡萄糖无法达到较好的分离。而Varian Metacarb Pb Plus阳离子交换色谱柱的柱流失极小，所使用的流动相水挥发性远弱于乙腈，检测基线波动可稳定在5 nRIU范围内，有利于提高示差折光检测器的检测灵敏度。同时，对葡萄糖、果糖和蔗糖可以实现完全的基线分离，而且各糖色谱峰的保留时间很稳定。Varian Metacarb Pb PLUS色谱柱通常使用去离子水作为流动相，经济、安全、清洁环保，而且方便流动相的随时更换，无需特别配制。因此，实验选用Varian Metacarb Pb Plus阳离子交换色谱柱。

表1 高效碳水化合物卡套色谱柱和Varian Metacarb Pb Plus色谱柱测葡萄糖、果糖和蔗糖的检测限比较Table 1 The comparison of detection limits of glucose,fructose and sucrose on the Carbohydrate High Performance cartridge column and Varian Metacarb Pb Plus column

2.1.2 流速的选择 流速对色谱柱的分离产生一定影响。高流速可以缩短分析时间，但另一方面也会使柱压大大升高，而且可能降低目标色谱峰与杂质峰的分离度。Varian Metacarb Pb PLUS色谱柱的最高耐压为1025 psi，因此实验选用较低的流速，实验使用同一标准溶液对比了 0.1、0.3、0.4、0.6 mL/min 4种流速。流速为0.1 mL/min时，果糖出峰时间在101 min，出峰时间过长，且果糖峰高仅为流速为0.4 mL/min时的71%。流速为0.3 mL/min和0.4 mL/min时，3种糖的色谱峰形和分离效果差别不大，与邻近的杂峰分离干净，流速为0.4 mL/min的分离时间较短，在27 min内3种糖出峰完毕（图1）。当流速为0.6 mL/min时，不利于某些样品的杂峰与目标色谱峰的分离。方法选用流速为 0.4 mL/min。

图1 果糖、葡萄糖和蔗糖标准色谱图（A）和烟草样品色谱图（B）Fig.1 The chromatograms of fructose, glucose and sucrose of a standard solution and a tobacco sample

2.2 前处理条件的选择

2.2.1 萃取溶液选择 0.01 mol/L氢氧化钠和水是提取烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖的常用萃取溶液，两者对3种糖的提取效率相当。烟草中含有多种酸，烟草样品的水提取液也呈偏酸性，其中的柠檬酸、酒石酸等酸性物质可催化蔗糖分解[8]，不利于样品提取液的长时间放置，尤其对于蔗糖含量较高的样品，蔗糖的分解更为明显。当使用0.01 mol/L氢氧化钠进行试样提取时，稀的氢氧化钠会中和样品提取溶液中的酸，使样品提取溶液呈碱性，可在较长的时间内有效的抑制蔗糖的分解，确保测试结果的真实性。

由表2可见，用水作为提取溶液时，随着样品提取溶液在室温下放置时间的延长，蔗糖含量逐渐减少，放置9.0 h后，蔗糖的测试含量为初始测试含量的65%，放置19.5 h后，蔗糖的测试含量仅为初始测试含量的41%；而葡萄糖和果糖的含量则随试样提取溶液放置时间的延长逐步增加。但是3种糖的总量保持一致，平均含量为 27.44%。用 0.01 mol/L氢氧化钠提取的试样溶液的3种糖的含量则较稳定，在20 h内3种糖的测试含量保持一致，这样有利于编制仪器进样序列对多个样品进行连续分析。因此，试验选取0.01 mol/L氢氧化钠作为提取溶液。

表2 水和0.01 mol/L氢氧化钠的烟草提取溶液葡萄糖、果糖和蔗糖含量随放置时间的变化Table 2 The variations of the contents of glucose, fructose and sucrose of tobacco solutions extracted by H2O and 0.01 mol/L NaOH with standing time

2.2.2 提取时间的选择 选取试样 A为样品，按1.2进行样品处理，把提取时间分别设置为15、30、45、60、90、120 min，结果见图2。蔗糖在15 min的时候基本提取完全，葡萄糖在30 min时提取量比在15 min时的略有增加，在30 min后则趋于稳定，果糖在60 min时已经基本提取完全。兼顾3种糖在不同提取时间的提取情况，为了保证各糖的完全提取，试验把提取时间设置为1 h。

图2 样品中果糖、葡萄糖和蔗糖在不同提取时间的提取量Fig.2 The extracted contents of fructose, glucose and sucrose of a sample in different extraction time

2.3 标准曲线和检出限

分别称取0.25 g葡萄糖、0.25 g果糖、0.20 g蔗糖，精确至0.0001 g，用0.01 mol/L氢氧化钠溶液溶解后转入100 mL容量瓶中，用0.01 mol/L氢氧化钠溶液定容至刻度。得葡萄糖、果糖和蔗糖浓度分别为 2500 µg/mL、2500 µg/mL 和 2000 µg/mL的标准储备液。再逐级用0.01 mol/L氢氧化钠溶液稀释至所需要的浓度。表3为合适的工作标准溶液浓度系列。分别对工作溶液进行HPLC测定，并以各糖色谱峰峰面积（y）对其浓度（x）进行线性回归分析，得标准曲线回归方程（表4）。由表4看出，方程的线性良好，相关系数均大于 0.999。检出限较低为0.002%～0.006%。

表3 工作标准溶液浓度系列 µg/mLTable 3 A series of concentrations of working standard solutions

表4 标准曲线的线性方程、相关系数、检出限Table 4 The linear equations, correlation coefficients and limits of detections

2.4 方法的重复性

按1.2处理方法对试样B进行5次平行测定，得方法精密度，以RSD%表示，结果见表5。果糖、葡萄糖和蔗糖的精密度小于 1%，方法的重复性良好。

表5 方法重复性试验结果Table 5 The test results of the repeatability of the method

2.5 方法的回收率

取样品B，以其5次平行测定的平均值作为计算其果糖、葡萄糖和蔗糖原始含量的依据（蔗糖、葡萄糖和果糖 5次平行测定的含量平均值分别为1.29%、3.96%和 5.75%），添加高、中、低 3个浓度水平的标准进行回收试验。由表6可见，果糖、葡萄糖和蔗糖的回收率为98.9%～101.8%，结果理想。

2.6 与离子色谱方法的比对

本方法和烟草行业推荐标准[9]进行了检测数据比对，结果见表7。两种方法的测试数值的相对平均偏差均小于5%，一致性较好。

表6 回收率试验结果Table 6 The test results of recovery

表7 本方法（LC）和离子色谱方法（IC）的测试数据比较Table 7 The comparison of the test data acquired with the constructed method and the ion chromatography method

2.7 烟草和烟草制品样品的测定

应用本方法对37个不同地区的烟草样品和36个国内外不同牌号的烟草制品样品进行分析测定。烟草样品中烤烟的蔗糖、葡萄糖和果糖的含量范围分别为0.07%～5.82%、2.78%～13.65%和4.99%～13.36%，白肋烟的蔗糖、葡萄糖和果糖含量极低，3种糖的总含量一般不高于0.2%。烟草制品样品的蔗糖、葡萄糖和果糖的含量范围分别为 0.26%～2.33%、1.13%～9.61%和 2.94%～11.00%。大多数烟草和烟草制品以果糖和葡萄糖含量最高，蔗糖含量相对较低。

3 小 结

本方法前处理简单，重复性好，准确性高，可操作性强，易于推广。方法只用超纯水作为流动相，无需使用乙腈等有毒有害的有机溶剂，清洁环保。

[1]Varandas S, Teixeira M J, Marques J C, et al.Glucose and fructose levels on grape skin: interference in Lobesia botrana behaviour[J].Anal Chem Acta，2004，513：351-355.

[2]Chávez-Servín J L, Castellote A I, López-Sabater M C.Analysis of mono- and disaccharides in milk-based formulae by high-performance liquid chromatography with refractive index detection[J].J Chromatogr A，2004,1043: 211-215.

[3]Fang Y Z, Wang Q J.Analysis of sugars in traditional Chinese drugs[J].J Chromatogr B, 2004, 812: 309-324.

[4]刘玉峰，李 黎，李东，等.高效液相色谱法测定食品中的单糖、双糖[J].食品科学，2007，28（3）：293-296.

[5]董爱军，张英春，杨鑫，等.高效液相色谱法测定甜菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉籽糖[J].食品工业科技，2008，29（12）：245-247.

[6]姜岷，雷丹，陈可泉，等.纤维素水解液厌氧发酵产丁二酸发酵液中有机酸和混合单糖的测定[J].分析化学，2009，37（4）：605-608.

[7]黄翼飞.高效液相色谱测定烟草中的果糖、葡萄糖和蔗糖[J].烟草科技，2010（1）：40-43.

[8]黄立新，余业棠.酸水解蔗糖生产转化糖的研究[J].食品科学，2003，24（3）：24-26.

[9]国家烟草专卖局.YC/T 251—2008烟草及烟草制品 葡萄糖、果糖、蔗糖的测定 离子色谱法[S].北京：中国标准出版社，2008.