1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建▲

赵丽娟 陈源红 唐华英 韦红玉 曾 怡

(右江民族医学院微生物学与免疫学教研室，广西百色市 533000)

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建▲

赵丽娟 陈源红 唐华英 韦红玉 曾 怡*

(右江民族医学院微生物学与免疫学教研室，广西百色市 533000)

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后，用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α，提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定，并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带，与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定，获得2个正向克隆;正向克隆经测序，克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。

人类免疫缺陷病毒1型;tat基因;分泌型真核表达载体

人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)Tat蛋白是HIV-1的反式激活因子，有2个外显子编码。tat基因的第一个外显子编码为72个氨基酸，是Tat的反式激活活性区;第二个外显子编码为Tat蛋白的羧基端，包含一个RGD基序，是Tat蛋白与受体αvβ3和α5β1整合素结合的部位。Tat蛋白是HIV-1病毒复制所必需的反式激活因子，已有研究证实Tat蛋白与HIV-1 RNA 5'端启动子上的反式激活反应元件(trans-activation responsive element，TAR)结合［1］，激活 HIV-1 长末端重复序列(long terminate repeat，LTR)，使其下游的基因得以表达，从而促进整个HIV-1转录的表达。Tat蛋白本身没有分泌信号，但是当T细胞急性感染HIV-1而细胞尚未死亡或通透性尚未改变时，Tat蛋白可被释放到细胞外间质，并可能作用于其他细胞或细胞内感染的其他病毒，发挥细胞转化或激活病毒复制周期的作用。本研究旨在构建HIV-1 tat基因重组的分泌型真核表达载体，为进一步研究分泌型Tat蛋白的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、DNA模板 PCR扩增所用的模板为缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3，由南京医科大学卢春教授馈赠。分泌型真核表达载体pSecTag2B购自美国Invitrogen公司。

1.1.2 试剂与仪器 根据GenBank中登记的HIV-1 tat基因设计PCR引物，并在PCR上、下游引物的5'端引入Hind III酶切位点，在上游引物5'端起始密码子ATG前添加了一个KOZAK序列(GCCACC)以增强基因的表达。PCR引物序列(下划线部分为Hind III酶切位点):P1 5'-AAG CTT GCC ACC ATG GAG CCA G-3'，P2 5'-AA G CTT CTA ATC GAA TGG ATC TG-3';预期片段大小为324bp。PCR引物均由上海捷倍思生物工程公司合成。Lammda DNA EcoR I+Hind III分子量标记、PCR所用试剂Taq DNA多聚酶及缓冲液、dNTP、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、小牛碱性磷酸酶购自Fermentas公司，100bp ladder DNA分子量标记为大连宝生物产品，感受态DH5α购自北京天根生化科技公司，质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自美国Omega公司。研究中主要使用下列仪器:1-15PK冷冻离心机(德国Sigma)，Mycycler PCR 仪(美国 Bio-Rad)，Chemidoc XRS型凝胶成像系统(美国Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 tat基因的扩增及纯化 取1 μL pNL4-3做模板，用PCR引物P1和P2，PCR扩增HIV-1 tat基因，PCR反应体系包括:引物P1 10pmoL;P2 10 pmoL;10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5 μL;MgCl22.5 mmol/L;dNTPs 每 种2.5 mmol/L;Taq DNA聚合酶 2单位;总反应体积50 μL扩增条件:预变性94℃ 5 min;按94℃ 1 min，59℃ 30 s，72℃1 min进行30个循环;最后72℃延伸5 min。取5 μL PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察确认扩增成功。平衡酚:氯仿法纯化剩余的PCR反应产物。

1.2.2 tat基因重组分泌型真核表达载体的构建 分别取1 μg PCR 产物和1 μg pSecTag2B，经 Hind III酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收DNA片段。T4 DNA连接酶16℃连接过夜后，转化感受态DH5α，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的 LB 平板，37℃培养16～18 h。挑取4个生长的细菌克隆至含100 μg/mL Amp的LB液体培养基，37℃、250 rpm/min振荡培养16～18 h。提取质粒，Hind III酶切初步鉴定。

1.2.3 tat基因重组分泌型真核表达载体中tat基因插入方向的鉴定及基因测序 经Hind III酶切初步鉴定为阳性的质粒，进一步用Nco I酶切进行重组的tat基因插入方向的鉴定。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察

经酶切鉴定的正向克隆质粒送公司进一步进行序列测定。

2 结果

2.1 HIV-1 tat基因的扩增及纯化 以pNL4-3质粒为模板，用引入限制性酶切位点的PCR引物，经PCR扩增并用1%琼脂糖凝胶电泳后，在约320bp处出现条带，与预期的324bp大小基本一致。电泳结果见图1。

图1 PCR扩增HIV-1 tat基因

2.2 限制性酶切初步鉴定tat重组分泌型真核表达载体从4个细菌克隆提取的质粒用限制性内切酶Hind III酶切，并用1%琼脂糖凝胶电泳后，共有3个克隆在约320bp和约5200bp位置出现条带，另有1个克隆未见目的基因条带。电泳结果见图2。

图2 tat重组分泌型真核表达载体的酶切鉴定

2.3 tat基因重组分泌型真核表达载体中tat基因插入方向的鉴定及基因测序 在分泌型真核表达载体pSecTag2B中610nt、903nt、2110nt、2330nt位置共有 4 个 Nco I酶切位点，tat基因序列有1个Nco I酶切位点，如果pSecTag2B中正向插入 tat基因，经 Nco I酶切后可出现 108bp、220bp、293bp、1433bp、3439bp共5个DNA片段;如果tat基因是反向插入pSecTag2B 中，经 Nco I酶切后可出现 221bp、294bp、441bp、1121bp、3439bp共5个DNA片段。结果显示，泳道2，3为正向克隆，泳道1为反向克隆。泳道2，3的正向克隆质粒送公司测序，结果显示正向克隆的 tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。

图3 Nco I酶切鉴定重组分泌型真核表达载体中tat基因的插入方向

3 讨论

在HIV-1感染的过程中，正常的宿主细胞始终暴露在游离的HIV-1病毒颗粒以及不断在体内循环的HIV-1编码蛋白中。虽然这些正常细胞不会被HIV直接感染，但是与HIV-1相关的蛋白接触会对他们的基因表达以及正常功能产生深远的影响。除了糖蛋白120(glycoprotein 120 gp120)，可溶性的HIV-1 Tat也由感染细胞分泌并且可以和靶细胞表面的 αvβ3 以及 α5β1 整合素结合［2，3］。该结合过程依赖于Tat蛋白羧基端的高度保守序列精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)，RGD与细胞表面受体的结合可诱导细胞内信号通路的活化，最终导致靶细胞基因表达的改变此外，细胞外Tat可与细胞膜非特异性结合并内化入细胞［2，4］。细胞内化的Tat蛋白可直接与细胞基因作用而改变基因表达。

在美国，有超过20%的AIDS患者同时患有卡波济肉瘤(Kaposi's sarcoma，KS)，这类KS称为 AIDS-KS。多项研究表明KSHV的感染与KS的发生密切相关，而HIV-1感染者更容易发生KS。本课题组先前的研究证实［5，6］，细胞内表达的Tat蛋白可激活潜伏的KSHV的复制周期，并促进Kaposin蛋白介导的类 KS肿瘤形成。探讨 Tat蛋白在AIDS-KS发生机制中的作用，对研究AIDS-KS的预防和治疗方法有重要意义。

本研究采用PCR法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat全基因，利用Hind III单酶切并克隆入分泌型真核表达载体pSecTag2B中，进一步用Nco I对插入的tat基因进行插入方向的鉴定后，最后进行基因测序。测序结果与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源，表明我们获得了正向插入的tat基因重组分泌型真核表达载体。由于我们未购买到抗Tat蛋白抗体，因此未能利用Western blot(WB)法进行Tat蛋白表达的检测。在下一步的研究中，本项目组将采用基因转染、WB、CAT-LTR ELISA的方法，将tat基因重组分泌型真核表达载体转染293细胞，检测构建的重组载体中tat基因在293细胞中表达的Tat蛋白，并进一步检测表达的Tat蛋白的反式激活活性Tat蛋白分泌情况，最终验证本研究构建的tat基因重组分泌型真核表达载体。该载体最终鉴定后可用于研究分泌型Tat蛋白在激活KSHV复制周期和促进AIDS-KS发生发展中的作用。

［1］ Barillari B，Ensoli B.Angiogenic effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1 tat protein and its role in the pathogenesis of AIDS-associated Kaposi's sarcoma［J］.Clinical Microbiology Reviews，2002，15(2):17.

［2］ Barillari G，Gerdelman R，Gallo KC，et al.The Tat protein of human immunodeficiency virus type 1，a growth factor for AIDS Kaposi sarcoma and cytokine-activated vascular cells，induces adhesion of the same cell types by using integrin receptors recognizing the RGD amino acid sequence［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(17):7941－7945.

［3］ Ensoli B，Barillari G，Salahuddin SI，et al.Tat protein of HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi＇s sarcoma lesions of AIDS patients［J］.Nature，1990，345(6270):84 －86.

［4］ Sood V，Ranjan R，Banerjea AC.Functional analysis of HIV-1 subtypes B and C HIV-1 Tat exons and RGD/QGD motifs with respect to Tat-mediated transactivation and apoptosis［J］.AIDS，2008，22(13):1683－1685.

［5］ Zeng Y，Zhang X，Huang Z，et al.Intracellular Tat of human immunodeficiency virus type 1 activates lytic cycle replication of Kaposi＇s sarcoma-associated herpesvirus:role of JAK/STAT signaling［J］.J Virol，2007，81(5):2401 －2417.

［6］ Chen X，Cheng L，Jia X，et al.Human immunodeficiency virus type 1 tat accelerates Kaposi sarcoma-associated herpesvirus Kaposin A-mediated tumorigenesis of transformed fibroblasts in vitro as well as in nude and immunocompetent mice［J］.Neoplasia，2009，11(12)1272－1284.

Construction of secretory eukaryotic vector of tat gene from human immunodeficiency type 1

ZHAO Li-Juan，CHEN Yuan-Hong，TANG Hua-Ying，WEI Hong-Yu，ZENG Yi(Department of Microbiology and Immunology of Youjiang Medical University For Nationalities，Baise 533000，China)

ObjectiveTo construct secretory eukaryotic expression vector of tat gene from human immunodeficiency type 1(HIV-1).MethodsHIV-1 tat gene was amplified from pNL4 －3 plasmid，which was HIV-1 genome deleted pol gene，with polymerase chain reaction(PCR).Tat DNA fragments and secretory eukaryotic expression vector，pSecTag2B were then digested with Hind III.Digested pSecTag2B fragments were further dephosphorylated with calf intestinal alkaline phosphatase(CIP).Digested tat DNA fragments and pSecTag2B fragments were ligated overnight with T4 DNA ligase and were further transformed to E.coli competent cells DH5α.Furthermore，recombinant plasmids were extracted and determined by digestion with Hind III restricted enzyme.Moreover，the direction of inserted tat gene in recombinant plasmids was detected with Nco I restricted enzyme.Consequently，plasmids from norientation clone were sequenced.ResultsA band about 320bp as expecting(324bp)was visible when PCR products were electrophoresis in 1%agarose.Digested with Hind III and Nco I enzyme respectively，2 positive norientation clone were determined.Thesequence of tat gene cloned in norientation plasmid was 100%homology with HIV-1 tat gene registered in GenBank.ConclusionHIV-1 tat gene can be cloned into secretory eukaryotic vector successfully.

Human immunodeficiency virus type 1;Tat gene;Secretory eukaryotic expression vector

R 349.83

A

1673-6575(2012)04-0347-04

广西自然科学基金项目(桂科自0728246，桂科青0728105)，广西教育厅项目(桂教科研［2006］26号200610LX123);右江民族医学院项目(右医科字［2007］2号);广西百色市科学研究与技术开发计划课题(百科计字［2006］13号)

赵丽娟(1967～)，女，硕士，副教授，研究方向:分子病毒学。

*通讯作者

2012-03-06

2012-04-28)