VEGF在早期自然流产患者血清及绒毛组织中的表达及临床意义▲

韦舟玲 庞丽红 杨冬梅 黎欧阳 石 凌

(1广西医科大学，南宁市 530021;2广西医科大学第一附属医院妇产科，南宁市530021)

VEGF在早期自然流产患者血清及绒毛组织中的表达及临床意义▲

韦舟玲1庞丽红2*杨冬梅2黎欧阳2石 凌2

(1广西医科大学，南宁市 530021;2广西医科大学第一附属医院妇产科，南宁市530021)

目的观察孕早期自然流产患者血管内皮生长因子(VEGF)在血清及绒毛组织中的表达水平，探讨VEGF与妊娠关系。方法选择孕早期自然流产患者25例为观察组，正常早期妊娠妇女25例为对照组，应用ELISA法检测血清VEGF含量，采用免疫组织化学方法测定各组孕妇绒毛组织VEGF的表达。结果正常早孕组与孕早期胚胎停育患者血清及绒毛VEGF表达比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论VEGF表达异常与复发性流产具有相关性，其表达水平升高可能是导致孕早期胚胎停育的原因之一。

血管内皮生长因子;自然流产;酶联免疫吸附测定;免疫组织化学

近年来的研究表明，复发性流产的发生与胎盘组织中血管增生平衡和胎儿血液供应不足有密切关系，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最主要的促进血管形成的血管形成增生调节因子，在保持蜕膜组织中血管密度、有效血流量和维持胎儿营养供应上起重要作用。成功的妊娠依赖于胎盘良好的发育和生长，在胎盘植入和胎盘形成的过程中，血管的生成对于成功妊娠是非常关键的。虽然对于胎盘血管生成的调控因素还不清楚，但人们已认识到胎盘血管的发育是由多种生长因子及其受体调节完成，这些因子的不正常表达可能导致胎盘血运障碍，在胎盘形成过程中血管功能不全是导致自然流产等产科并发症的重要因素［1］。

国内外一些学者认为，VEGF升高导致流产发生［2］，VEGF表达水平降低可能也与流产的发生有关［3］。本研究采用酶联免疫吸附法和免疫组织化学测定自然流产胚胎停育时患者的外周血清及绒毛组织中VEGF表达情况，探讨VEGF水平及表达在胚胎停育中可能产生的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年9月至2011年11月在我院门诊就诊的25例胚胎刚停育的自然流产患者作为观察对象，患者年龄25～36岁，均排除解剖、遗传、感染等因素，孕8周前曾B超检查提示胚胎发育良好，可见原始心管搏动，孕8～12周，经临床病史、体征、B超、尿人绒毛膜促性腺激素(hCG)检测确定已经发生难免流产者。选取同期在我院计生门诊要求进行人工流产的健康早孕妇女25例为对照组，年龄25～36岁，孕8～12周，年龄、孕周与自然流产组相比差异无统计学意义，并均符合以下要求:①本次妊娠以前有过正常妊娠和分娩史，无死胎、死产、自然流产史;②本次妊娠期间无先兆流产症状和体征;③B超提示胚胎发育正常;④无服药及病毒感染史，无其他内科疾病。

1.2 外周血VEGF水平的检测 标本采集取自自然流产25例孕妇早晨空腹时肘静脉血 2 mL，静止 1 h后，2000 r/min离心15 min，取血清置于－70℃冰箱保存待测;取对照组孕妇肘静脉血，同法处理。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定已分离保存的血清中VEGF浓度。操作按试剂盒(购自美国R＆D System公司)的说明书进行。所有标本均设3个复孔且为同批测定，均值为最终浓度，批内变异＜5%，由专人检测。

1.3 免疫组化法检测绒毛组织VEGF蛋白水平

1.3.1 绒毛的采集与保存 将手术后采集的绒毛组织用0.9%生理盐水冲洗后立即置于4%的甲醛液中固定24～48 h，常规石蜡包埋后制成4～5 μm厚的组织切片。

1.3.2 试剂及方法 采用免疫组化二步法染色，观察绒毛组织中 VEGF的分布及表达。一抗为鼠抗人 VEGF及sFlt-1单克隆抗体工作液，即用型Envisio TM试剂盒，DAB均购自北京中衫生物技术有限公司。染色步骤参照说明书进行。用已知的阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。切片集中染色，以免批内、批间误差。

1.3.3 结果判定 采用双盲法观察阳性反应。VEGF表达阳性信号为棕黄色，位于胞浆，每张切片随机观察10个视野，按阳性细胞占总细胞的百分比分为4级，阴性(－):阳性细胞数＜5%;阳性(+):阳性细胞数5% ～25%;中度阳性(++):阳性细胞数25% ～50%;强阳性(+++):阳性细胞数＞50%。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料用±s表示，采用t检验;计数资料用率表示，采用χ2检验或秩和检验进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自然流产组和对照组孕妇外周血中 VEGF检测 ELISA法测定两组孕妇外周血清中VEGF水平，显示资料符合正态分布，结果见表1。自然流产组外周血中VEGF 的水平为(2 037.20±1 125.09)ng/L，远高于对照组外周血中 VEGF 的水平［(882.67 ±595.47)ng/L］。两者间差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 外周血VEGF水平比较 (±s)

表1 外周血VEGF水平比较 (±s)

注:自然流产胚胎停育组与正常健康早孕组比较，P＜0.01。

组别 n 外周血VEGF水平(ng/L)自然流产胚胎停育组25 2 037.20 ±1 125.09正常健康早孕组25 882.67 ±5955.47

2.2 自然流产胚胎停育及正常早孕绒毛组织VEGF蛋白表达 自然流产胎停育组绒毛组织VEGF蛋白表达水平较正常早孕组高，阳性细胞大于50%的率也较正常健康早孕组高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。详见表2、图1及图2。

表2 两组绒毛上皮组织合体滋养细胞VEGF表达

图1 RSA组绒毛VEGF的免疫组化(苏木素复染×400)

图2 正常早孕组绒毛VEGF的免疫组化(苏木素复染×400)

3 讨论

早期自然流产是产科常见的病理性妊娠之一，病因复杂，发病机制仍不明确。VEGF作为一种主要的血管内皮细胞促血管生长因子，具有使微静脉、小静脉通透性增加，促进血管内皮细胞分裂、增殖和细胞浆中钙离子聚集等作用。Krussel等［4］研究证实VEGF在人类胚胎种植前的胚胎上的表达对于着床过程中的血管形成是必需的;他们用逆转录PCR方法检测了在IVF过程中获得的19个人类囊胚期胚胎，发现VEGF mRNA在89%的胚胎上表达。

叶喜阳等［2］研究发现，反复自然流产(RSA)患者的血清及绒毛中VEGF水平较正常早孕者升高，与我们研究的结果相符。Nagamatsu等［5］认为，妊娠早期胚胎是在一个相对缺氧的环境中发育的，其后随着滋养层细胞的不断侵入，胎盘供氧改善，母胎物质交换得以完善，在缺氧条件下sFlt-mRN表达明显升高。病理妊娠时，滋养层细胞浸润表浅与螺旋动脉重铸不良的直接后果是子宫胎盘血流灌注不足和缺血、缺氧，这对滋养层细胞乃至整个胎盘的功能产生重要影响，并与子痫前期等妊娠疾病的病理机制有关［6，7］。体内和体外由低氧诱导因子所诱导的低氧环境使VEGF mRNA出现高表达。

本研究显示，自然流产胚胎停育患者血清及绒毛组织中VEGF的表达水平均高于正常妊娠组，差异有统计学意义(P＜0.001)。自然流产胎停育患者较正常早孕绒毛组织VEGF蛋白表达水平高，提示胚胎停育的发生可能与患者血清VEGF和妊娠绒毛组织中VEGF表达水平增高有关。Neufeld等［8］研究推测，低氧VEGFR表达增加的机制可能为:HIF-1与其在VEGF启动子上的结合位点结合，介导了低氧诱导的VEGF mRNA的转录，致使VEGF产生增加。

本研究表明VEGF表达异常与复发性流产具有相关性，其表达水平升高可能是导致孕早期胚胎停育的原因之一。但VEGF对自然流产的作用机制尚未完全阐明，对VEGF进行深入研究，为自然流产患者提供临床防治依据是我们今后的努力方向。

［1］ Torry DS，Hinrich SM，Torry RJ.Departments of placental vascularity［J］.Am J Reprod Immunol，2004，51(4):257 －268.

［2］ 叶喜阳，徐宏星，徐洪斌.反复自然流产血清及绒毛组织中NO含量和NOS活性及血清中 VEGF含量［J］.中国妇幼保健，2004，14(8):19 －21.

［3］ 郑 颖，左常婷，刘爱兰，等.VEGF在复发性流产患者绒毛及蜕膜中的表达［J］.中国妇幼保健，2009，24(6):276 －278.

［4］ Krussel JB，Behr B，Milki AA，et al.Vascular endothelial growth factor mRNA splice variants are differentially expressed in human blastocysts［J］.Mol Hum Reprod，2001，7(1):57 －63.

［5］ Nagamatsu T，Fujii T，Kusumi M，et al.Cytotrophoblasts up-regulate soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression under reduced oxygen:an implication for the placental vascular development and the pathophysiology of preeclampsia［J］.Endocrinology，2004，145(11):4 838－4845.

［6］ Redman CW，Sargent IL.Latest advances in understanding preeclampsia［J］.Science，2005，308(28):592 － 594.

［7］ Merviel P，Carvillon L，Challier JC，et al.Pathophysiology of preeclampsia:links with implantation disorders［J］.European J Obstet Gynecol Reprod Biol，2004，15(2):34 －47.

［8］ Neufeld G，Cohen T，Gengrinovitch S，et al.VEGF and its receptors［J］.FASEB J，l999，l3(1):9 －22.

Expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor in the serum and chorionic villi in patients of early spontaneous abortion

WEI Zhou-ling，PANG Li-hong ，Li Ou-yang(Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

ObjectiveTo observe the expression level of vascular endothelial growth factor(VEGF)in the serum and chorionic villus of embryo growth arrest patients，and to explore the relationship between VEGF and early spontaneous abortion.MethodsIn 25 cases of early spontaneous abortion and 25 cases of normal early pregnancy groups，the level of VEGF in serum was measured by enzyme － linked immunosorbent assay and expression of chorionic villus tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsThe level of VEGF expressions in both serum and chorionic villus tissue were increased in embryo growth arrest patients compared to those in controls(P ＜0.01).ConclusionThere are relationship between the abnormal expression of VEGF and early spontaneous abortion.The high expression of VEGF may be involved in the pathogenesis of embryo growth arrest.

Vascular endothelial growth factor;Spontaneous abortion;Enzyme-linked immunosorbent assay;Immunohistochemistry

R 714.21

A

1673-6575(2012)06-0582-03

国家自然科学基金(81060053);广西2011年研究生教育创新计划资助项目(2011105981002M212);广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻11217004)

韦舟玲(1986～)，女，硕士研究生，研究方向 :母亲胎儿医学。

*通讯作者

2012-07-28

2012-09-27)