散发型白癜风患者外周血CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+T细胞的检测

叶蓉，马刚，胡小平，彭曦

（北京大学深圳医院，深圳 518036）

散发型白癜风患者外周血CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+T细胞的检测

叶蓉，马刚，胡小平，彭曦

（北京大学深圳医院，深圳 518036）

目的检测散发型白癜风患者外周血CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+调节性T细胞水平，探讨其与散发型白癜风发病的关系。方法散发型白癜风患者29例，男13例，女16例。通过流式细胞仪对散发型白癜风患者外周血CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+调节性T细胞水平进行检测，并与20例健康人相比较。结果与健康对照组相比，散发型白癜风患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比值的差异无统计学意义（P＞0.05），而CD4+CD25+调节性T细胞水平明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），但在不同病程的患者中CD4+CD25+调节性T细胞数量的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论散发型白癜风患者外周血中存在CD4+CD25+调节性T细胞水平下降，可能与散发型白癜风的发生发展有一定关系。

散发型白癜风；CD4/CD8 T细胞比值；CD4+CD25+调节性T细胞

白癜风是一种常见的获得性色素脱失性皮肤病，包括局限型、节段型、肢端颜面型、散发型和泛发型。白癜风的发病机制尚未完全阐明，自身免疫学说越来越受到关注。CD4+CD25+调节性T细胞（T regulatory cells,Treg）是一群具有免疫抑制及免疫无能作用的T细胞亚群，对维持机体免疫自稳和免疫耐受有重要作用，其数量的缺乏或功能的缺陷与多种人类自身免疫性疾病的发生密切相关[1]。研究表明[2-3]，CD4+CD25+Treg水平或功能降低可能在白癜风发病中发挥重要作用。CD4+/CD8+T细胞比值的变化可反应机体免疫失调情况。因此，本实验通过检测散发型白癜风患者外周血CD4+/CD8+T细胞比值和CD4+CD25+Treg水平，探讨其与散发型白癜风发病及进展的关系，可能为散发型白癜风的诊断及疗效评价提供新的实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 根据中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组修定的《白癜风临床分型及疗效标准》，我院皮肤科门诊确诊散发型白癜风29例，男13例，女16例，年龄20～64岁，平均33.66岁，病程30 d～20年，平均2.97年。所有患者均排除其他自身免疫性疾病、肿瘤及心血管疾病等，女性排除妊娠及哺乳期者，检测前1个月内未接受任何治疗。正常对照组为我院健康体检者，男10例，女10例，平均年龄35.18岁。病例组和对照组的年龄、性别差异无统计学意义。

1.2 主要试剂和仪器 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记抗人CD4抗体、藻红蛋白（phycoerythrin,PE）标记抗人CD25抗体、FITC标记小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）同型对照及PE标记小鼠IgG同型对照的抗体购自美国BioLegnd公司，Simultest IMK Lymphocyte试剂盒购自美国BD公司，红细胞裂解液购自上海瑞齐生物技术有限公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集及处理 抽取肘正中静脉血5mL，放入肝素化试管中，倒转摇匀，6 h内检测。小心吸取抗凝全血100μL，分别加抗CD3-FITC、抗CD4-PE抗体各10μL，充分混匀，室温避光孵育20min，加入红细胞裂解液2mL，充分混匀，室温避光孵育10min，至液体透亮，1 000 r/min离心5min，弃上清。加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）洗涤液2mL，1 000 r/min离心5min，弃上清，洗涤2次。将细胞悬浮于0.5mLPBS液中，振荡混匀后上流式细胞仪检测CD3+CD4+T细胞。同理用抗CD3-FITC、抗CD8-PE抗体测定CD3+CD8+T细胞，用抗CD4-FITC、抗CD25-PE抗体测定CD4+CD25+Treg。

1.3.2 流式细胞仪分析 以前向角散射（forward scatter，FSC）/侧向角散射（side scatter,SSC）二维散射光图确定淋巴细胞群体，收集至少1×104个淋巴细胞，每例样本设1个同型对照，检测其百分率。利用功能软件得到CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+Treg细胞水平分析。

1.3.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据用（±s）表示，2组间比较采用t检验，3组间比较采用方差分析和LSD检验，显著性水平α＝0.05。

2 结果

2.1 2组外周血CD4+/CD8+T细胞比值和CD4CD25Treg结果 正常对照组与散发型白癜风患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比值的差异无统计学意义（P＞0.05）。散发型白癜风患者CD4+CD25+Treg表达水平明显低于正常对照组，2组相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 散发型白癜风患者外周血CD4+CD25+Treg水平与病程的关系 将29例患者按病程长短分成3组：＜6个月、6个月～2年和≥2年。方差齐性分析统计示F=0.997，方差齐。进一步用LSD检验显示：不同病程中散发型白癜风患者外周血CD4+CD25+Treg数量的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 散发型白癜风患者CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+Treg水平

表2 散发型白癜风患者在不同病程中CD4+CD25+Treg水平

3 讨论

众多临床及实验研究表明，自身免疫机制在白癜风的发生发展中具有重要作用[4]。本实验结果提示，散发型白癜风患者体内存在免疫功能的缺陷。与健康对照组相比，散发型白癜风患者外周血CD4+CD25+Treg水平明显减少，但和病程长短无明显关系。王小霞等[2]发现，白癜风患者外周血CD4+CD25+Treg数量低于正常，CD4+CD25+/CD4+T细胞比例显著低于对照组。白明辉等[3]实验也表明，白癜风患者外周血中CD4+CD25+Treg的数量与病程无相关性。这与本研究结果基本相符，因而推测散发型白癜风患者外周血中CD4+CD25+Treg水平下降，可能与散发型白癜风的发生发展有关系。本研究还检测到散发型白癜风患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比值无明显差异。王忠等[5]研究发现，泛发型白癜风患者CD4+/CD8+T细胞比值降低而局限型变化不明显；而李东宁等[6]却发现泛发型、局限型白癜风患者CD4+/CD8+值均降低，仅肢端型未见到明显异常。这与本研究结果不一致，造成这些差异可能与白癜风患者皮损面积、各型免疫反应强弱、患者地域不同等诸多因素有关。

T淋巴细胞是机体最重要的免疫细胞，根据其免疫表型与功能的不同又分为2个亚群：CD4+辅助性T细胞与CD8+细胞毒性T细胞。初始CD4+T可分化为Th1和Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞。Th1和Th2细胞互相调节，处于动态平衡，维持机体免疫系统的正常。Th17主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等，IL-17可与多种细胞表面IL-17受体结合，诱导某些自身免疫病的发生[7]。活化的Treg表面表达CD4、CD25抗原，可抑制移植物排斥、食物不耐受及自身免疫等反应。在多种自身免疫性疾病中，CD4+CD25+Treg发挥着保护作用，而Th17数量或功能的增强则是重要的致病因素之一[8]。而Sujino等[9]研究表明，CD4+CD25+Treg能够抑制Th17向Th1细胞的转化，延缓结肠炎的进展。

本实验提示CD4+CD25+Treg可能在散发型白癜风发生发展中起着重要作用，为散发型白癜风病因学研究提供一定的理论依据，然而其究竟是通过何种途径发挥作用的，散发型白癜风患者体内Th1、Th2、Th17和IL-17等因素的变化情况及其关系如何，仍有待进一步研究证实。

［1］Jiang S,Lechler RI.CD4+CD25+regulatory T-cell therapy for allergy, autoimmune disease and transplant rejection[J].Inflamma Allergy Drug Targets,2006,5：239-242.

［2］王小霞，余春艳，张英起，等.银屑病和白癜风患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的检测[J].中国麻风皮肤病杂志，2009，25:576-578.

［3］白明辉，王竞，涂彩霞，等.白癜风患者外周血CD4+CD25+调节T细胞的检测[J].中华皮肤科杂志，2009，42（7）:460-462.

［4］Ongenae K,Van Geel N,Naeyaert JM.Evidence for an autoimmune pathogenesisofvitiligo[J].PigmentCellRes,2003,16:90-100.

［5］王忠，王伟深，邹兴梅，等.白癜风患者外周血T淋巴细胞亚群检测及其意义[J].中国麻风皮肤病杂志，2004，20（5）:448-449.

［6］李东宁，裴洪菊，周和清，等.白癜风患者外周血T淋巴细胞亚群的检测[J].中国皮肤性病学杂志，2006，20（7）：420-421.

［7］HamzaouiK.Th17 cells in Behcet's disease:anew immunoregulatory axis[J].Clin Exp Rheumatol,2011,29:S71-76.

［8］Jadidi-Niaragh F,Mirshafiey A.The deviated balance between regulatory T cell and Th17 in autoimmunity[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2012,34:727-739.

［9］SujinoT,KanaiT,OnoY,etal.RegulatoryTcellssuppressdevelopment of colitis,blocking differentiation of T-helper 17 into alternat ive T-helper1cells[J].Gastroenterology,2011,141:1 014-1 023.

Detection ofCD4+/CD8+TLymphocyteRatioand CD4+CD25+Treg in PeripheralBlood ofPatientsw ith Sporadic Vitiligo

YERong,MAGang,HUXiaoping,PENGXi
PekingUniversityShenzhenHospital,Shenzhen518036,China

ObjectiveTo detect the CD4+/CD8+T lymphocyte ratio and the CD4+CD25+Treg level in peripheralblood of patientswith sporadic vitiligo,and to investigate its role in the pathogenesis of sporadic vitiligo.Methods Peripheral blood sampleswere taken from 29 outpatientswith sporadic vitiligo,including13malesand 16 females.The CD4+/CD8+T lymphocyte ratioand the CD4+CD25+Treg levelwasdetected in peripheralblood ofpatientswith sporadic vitiligoby flow cytometry,aswell as controlled samples from 20 healthy human.ResultsThere was no difference on the ratio of CD4+/CD8+T lymphocyte between the patientswith sporadic vitiligo and healthy people（P＞0.05）.Compared to the controlled group,the proportion of CD4+CD25+Tregwassignificantly lower in sporadic vitiligo patients（P＜0.05）,but therewasnosignificantdifferenceamong the groups of different courseswith sporadic vitiligo(P＞0.05).ConclusionThe levelof CD4+CD25+Treg is lower in peripheral blood ofsporadic vitiligopatients,whichmightplay a role in thepathogenesisand developmentofsporadic vitiligo.

sporadic vitiligo;ratio ofCD4+/CD8+T lymphocyte;CD4+CD25+Treg

R758.4+1

A

1672－0709（2012）05-0281－03

2012-03-08）