生物肽SP对NK细胞活化性受体NCRs表达的影响

傅炜昕，秦博，顾鹏毅，黄勤俊，梁再赋

(中国医科大学实验技术中心一部暨国家中药管理局中药生物工程科研Ⅲ级实验室，辽宁沈阳110001)

神经内分泌系统对机体免疫功能具有重要的调控作用。生物肽P物质(Substance P，SP)不仅是一种重要的神经递质，而且还是神经系统、内分泌系统和免疫系统共同的化学语言［1］。中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞是SP的主要来源，而免疫细胞是SP的另一来源。外周神经末梢释放SP参与免疫调节和炎症过程，免疫细胞产生的SP则以自分泌或/和旁分泌的方式调节免疫细胞的功能，已有实验证明SP可从多方面影响各种免疫细胞［2-3］。自然杀伤细胞(Naturalkillercells，NK细胞)是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫细胞。NK细胞功能的发挥主要依赖于NK细胞能表达多种与主要组织相容性抗原(MHC)和非MHC类配体结合的受体，而传递的抑制或激活信号，NK细胞的活化取决于激活信号与抑制信号的平衡［4-5］。已发现的NK细胞表面的活化性受体包括自然细胞毒受体(Natural cytotoxicity receptors，NCRs)、NKG2D、活化杀伤免疫球蛋白样受体(Killer immunogloblin-1ike receptors，KIRs)及其他辅助刺激活化性受体2B4、DNAM-1、NTB-A、CD59等［4］。目前，关于SP对NK细胞生物学功能的调控及作用机制的研究，国内外报道较少，且其作用机制尚未明确。本研究以非IL-2依赖的NK92-MI细胞株为对象，研究SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响，并测定SP对NK92-MI细胞活化性受体NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)的表达的影响，以阐明SP对NK细胞杀伤功能的调节作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料α-MEM培养基(Invitrogen)，马血清及胎牛血清(Hyclone)，SP(Sigma)。

1.1.2 试剂Trizol试剂(Invitrogen)，Real-Time PCR反应试剂盒(TaKaRa)，流式细胞抗体(APCNKp46单抗、PE-NKp30单抗、NKp44单抗，R＆D)。

1.1.3 主要仪器流式细胞仪(BD)，PCR仪(MJ Research Inc)，Real-Time PCR System(ABI PRISM)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响取对数生长期的NK92-MI细胞(4×105/mL)，接种于96孔培养板(100 μL/孔)用不同浓度的SP(10－14、10－12、10－10、10－8、10－6mol/L)刺激24 h，作为效应细胞;以K562细胞为靶细胞，效靶细胞共同孵育4 h(效靶细胞比为4∶1);加入MTT液(5 mg/mL)，再继续孵育4 h;然后各孔吸弃上清液，加入DMSO和甘氨酸缓冲液，振荡15～20 min;用酶标仪于570 nm处测定OD值。按下列公式计算NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤率:

NK细胞杀伤率(%)=(1－(杀伤实验组OD值－效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值)×100%

1.2.2 Real-Time PCR检测活化性受体NCRs的mRNA表达水平①引物设计:NKp44、NKp46、NKp30的引物用Primer Premier 5.0软件设计，由金思特科技有限公司(南京)合成，各引物序列见表1;②Real-Time PCR:取对数生长期的NK92-MI细胞(约1×107个)，用不同浓度的SP(10－14、10－12、10－10、10－8mol/L)分别作用4、12和24 h，在各时间点收集细胞;用异硫氰酸胍(Trizol)法提取总RNA。RT反应体系为10 μL(细胞总RNA 1.0 μL、5×Prime Script TM Buffer 4.0 μL、Prime Script TM Enzyme MixⅠ0.5 μL、Oligo dT引物0.5 μL、随机引物6 0.5 μL、无RNA酶H2O 3.5 μL);反转录反应条件为37℃、15 min(反转录反应)，85℃、5 s(反转录酶的失活);PCR反应体系为20 μL(模板cDNA 2.0 μL、SYBY Primix Ex TaqTM 10 μL、PCR上游引物0.4 μL、PCR下游引物0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、无菌H2O 6.8 μL);PCR反应为2步法:①95℃，30 s(预变性);②95℃，5 s;60℃，34 s(40个循环);应用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System进行检测，以18S rRNA作参照基因，用2－ΔΔCt法比较实验组相对表达量与对照组的倍数差异，计算公式如下:

表1 Real-Time PCR用引物Table 1 Primer sequences used in real-Time PCR

1.2.3 流式细胞术检测NK92-MI细胞NKp44、NKp46和NKp30的膜表达取对数生长期的NK92-MI细胞(1×106/mL)，接种于6孔板，用10－14～10－8mol/L的SP作用24 h，收集细胞，用人IgG室温封闭Fc受体(15 min);加入荧光标记单抗(PE-NKp30单抗或APC-NKp46单抗或未标记的NKp44单抗)，4℃避光孵育30～45 min;未标记的NKp44抗体还需与FITC标记的二抗再孵育30 min。细胞重悬于含0.5%BSA的PBS缓冲液中，上流式细胞仪检测。

1.2.4 统计学分析所得实验数据均以均数±标准差(¯χ±SD)表示，各组间均数比较采用一维方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。应用SPSS 13.3统计分析软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 SP对NK92-MI细胞杀伤活性的增强作用

经一定浓度(10－14～10－6mol/L)的SP作用24 h后，用MTT释放法检测NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性。结果显示较低浓度的SP对NK92-MI细胞的杀伤活性均显示有增强作用(10－14mol/L组:89.74%，10－12mol/L组:95.66%，10－10mol/L组:94.6%，10－8mol/L组:88.89%)，其中10－14～10－10mol/L组与对照组(78.31%)比较，具有非常显著性差异(P＜0.01)，10－8mol/L组具有显著性差异(P＜0.05)。而高浓度10－6mol/L的SP对NK92-MI细胞的杀伤活性则无明显影响。

2.2 SP增加NK92-MI细胞活化性受体NCRs的mRNA表达

选择促杀伤活性作用较强的浓度(10－14～10－8mol/L)的SP刺激NK92-MI细胞4、12和24 h后，NCRs的mRNA表达水平用Real-Time PCR法进行测定，结果见表2和图1。

表2 NK92-MI细胞NCRs mRNA的相对定量(¯χ±SD)Table 2 Relative quantitation of NCRs mRNA in NK92-MI cells(¯χ±SD)

图1 NCRs的Real-time PCR扩增曲线图Fig.1 Real-time PCR amplification curve of NCRs

2.2.1 SP对NKp46 mRNA表达水平的影响高浓度(10－8mol/L)SP作用4 h，NKp46的mRNA表达已开始增加;较高浓度(10－10～10－8mol/L)SP作用12 h，NKp46的mRNA表达呈增加趋势(P＜0.05);作用24 h时，各浓度的SP均可明显增加NKp46的mRNA水平，与对照组比较，差异性非常显著(P＜0.01)。

2.2.2 SP对NKp44 mRNA表达水平的影响高浓度(10－8mol/L)SP作用4 h，NKp44的mRNA表达已增加(P＜0.05);较高浓度SP作用12 h，NKp44的mRNA表达亦呈增加趋势，其中10－10～10－8mol/L组P＜0.01、10－12mol/L组P＜0.05;作用24 h时，各浓度的SP均可明显增加NKp44的mRNA水平，与对照组比较，有非常显著性差异(P＜0.01)。

2.2.3 SP对NKp30 mRNA表达水平的影响高浓度(10－8mol/L)SP作用12 h，NKp30的mRNA表达已明显增加(P＜0.01);较高浓度(10－10mol/L)SP作用12 h，NKp30的mRNA表达也有所增加(P＜0.05);作用24 h时，各浓度的SP均可明显增加NKp30的mRNA水平，与对照组比较差异非常显著(P＜0.01)。

2.3 SP对NK92-MI细胞NKp46、NKp44及NKp30受体膜表达的影响

10－14～10－8mol/L的SP作用NK92-MI细胞24 h后，用流式细胞术检测NKp46、NKp44及NKp30的膜表达水平，结果见表3和图2。

表3 SP对NK92-MI细胞NCRs分子膜表达(%)的影响(¯χ±SD)Table 3 Effects on surface expression of NCRs in NK92-MI cells by SP(¯χ±SD)

各浓度的SP均可增加NKp46的膜表达，与对照组比较有非常显著性差异(P＜0.01);而NKp46膜表达水平的增高随SP浓度的升高而回落，提示SP的调节作用可能具有双向性。仅较低浓度(10－14mol/L)的SP对NKp44的膜表达有增加作用，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05);同样NKp44膜表达水平的趋势随SP浓度的升高而回落，高浓度(10－8mol/L)组甚至有所下降，但无统计学意义。各浓度的SP对NKp30的膜表达无明显影响(P＞0.05)。

图2 流式细胞仪检测NCRs膜表达Fig.2 FACS histograms of NCRs

3 讨论

SP是神经内分泌系统反应时分泌的一种生物活性多肽，广泛分布于细的初级传入神经纤维内。SP具有多种生理功能，且SP作为一种神经炎症因子，与临床的多种疾病有关。在各种生理和病理条件下，SP能以神经内分泌的方式作用于各种免疫细胞，参与免疫调节。已有一些研究证据表明SP对NK细胞的调节作用，SP可刺激外周血NK细胞的迁移和细胞毒活性，并调节炎症部位的NK细胞分泌IFN-γ，某些疾病状态致外周血SP浓度升高而抑制NK细胞的杀伤活性。可见，SP在不同条件下所起的作用具有复杂性和多样性［6-7］。

NK细胞参与免疫系统的发生、发展及效应等重要环节的调节过程，是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性免疫的核心调节细胞，NK细胞无需特异性抗原识别便可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。NK细胞介导的杀伤病毒感染细胞或肿瘤细胞的细胞毒作用主要归功于非HLA限制性活化性受体的表达，这类受体主要包括NCRs和NKG2D等［4，8-9］。NCRs为近年发现的一类非MHC限制的特异性启动NK细胞活化的表面分子，属于免疫球蛋白超家族受体，成员包括NKp46、NKp44和NKp30，其中NKp46和NKp30在所有静止和活化的NK细胞都表达，是NK细胞组成性表达受体;NKp44仅表达于活化的NK细胞，是人类NK细胞活化的最佳标志［10-12］。NCRs以非MHC依赖性方式直接杀伤靶细胞的活性使它们与其他活化性受体(如CD2和KIR2DS)区分开来。NCRs的配体至今还未明确，但推测白血病细胞表面表达NCRs的特异性配体。NCRs也可与病毒产物相互作用，NKp46和NKp44可识别流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素、神经酰胺酶病毒蛋白，发挥NK细胞的抗病毒效应［4，13-14］。NCRs的表达可受细胞因子、疾病状态、药物等的影响。NCRs在细胞表面的表达程度与NK细胞功能的发挥密切相关。目前有关SP对NK细胞功能性受体NCRs等表达的影响研究，尚少见报道。因此，对NCRs的表达情况以及SP对其表达的影响进行研究，不仅能揭示NK细胞的活化程度及功能状态，而且将在分子水平阐释SP对NK细胞生物学活性的调控作用及内在机制。

研究已证实生理浓度范围的SP对NK细胞的杀伤活性有增强作用;且SP通过增加NK细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶)的表达来直接调节其杀伤活性。鉴于NCRs分子与NK细胞杀伤活性的密切联系，进一步研究SP对NK细胞NCRs表达的影响。结果显示SP可同时增加3种活化性受体的转录水平，但对这些受体的膜表达的作用各不相同。推测SP可以作为一种活化因子，通过增加活化性受体NCRs的表达，来调节NK细胞的活性。其中NKp46参与这种调控作用，而与NKp30和NKp44无明显关系，这可能是同一细胞不同活化性受体竞争表达的结果。另外，SP对NKp46和NKp44膜表达水平的上调作用随着SP浓度的升高反而回落，提示SP对NK细胞的功能可能存在双向调节作用。研究结果进一步揭示了SP活化NK细胞、介导其免疫功能的效应分子，将为探索提高NK细胞对肿瘤、病毒感染细胞的杀伤活性，用于细胞过继免疫治疗提供新的思路，也有助于深入理解神经系统对NK细胞生物学活性及功能的调节作用。

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