1株红海榄根际纤维素降解真菌的分离鉴定及其酶学性质

潘虎，董俊德，卢向阳，田云，张偲，龙丽娟

(1.中国科学院南海海洋研究所中科院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广东广州510301;2.中国科学院海南热带海洋生物实验站，海南三亚572000;3.湖南省农业生物工程研究所，湖南长沙410128;4.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128)

随着经济和社会的发展，化石燃料的供应日益紧缺，寻找和开发可再生能源和新能源成为世界各国的普遍共识。纤维素是地球上光合作用的初级产物，它占植物干重的35%～45%，每年全球生物合成的可再生性纤维素达1 000亿t以上［1］。如何高效利用纤维素资源已成为关系国家能源安全的重要议题。由于微生物在纤维素利用方面的独特优势，寻找新的纤维素利用菌种和开发高产纤维素酶菌种，是纤维素资源高效利用的关键。红树林生态系统是处于热带、亚热带海岸潮间带，包括种类丰富的动物群落、红树木本植物群落、微生物群落的复杂而独特的生态系统，在沿岸自然海洋生态系统中能维持较高的生产力水平，是海岸带重要的湿地生态系统类型之一［2］。位于海洋、陆地交界处，由于潮间带生境的高度盐渍化、土壤的缺氧、高光辐射及周期性的海水浸淹，使其蕴涵大量的独特微生物、酶和基因资源［3］。红树林生态系统中，植物凋落物、有机碎屑含量非常丰富，且蕴涵着大量的可以降解纤维素、木质素和几丁质等大分子有机物的微生物。但由于红树林生态系统被认识的相对较晚，对其微生物资源的组成、分布、功能和结构知之甚少。虽然国内外关于纤维素降解菌株的研究报道有很多［4-5］，但有关来源于红树林生态系统的纤维素降解微生物的研究报道却很少。本文以我国海南三亚红沙河流域红树林沉积物为研究对象，对分离得到的1株产纤维素酶真菌进行了形态学、分子生物学的鉴定及其酶学特性研究。旨在为我国本土红树林生态系统中纤维素降解真菌的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品采集样品采集于2010年8月，为中国海南省三亚市红沙河口(18°13＇50.2″N，109°37＇15.8″E)红树林区红海榄Rhizophora stylosa植株根际0～30 cm深的土壤沉积物。样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，立即带回实验室4℃保存备用。

1.1.2 培养基①分离培养基:CMC-Na 10.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 1.5 g，刚果红0.2 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌后等培养基冷却至60℃加入过滤除菌的100 μg/mL氨苄青霉素和100 μg/mL硫酸链霉素各1 mL;②改良PDA培养基:马铃薯汁(马铃薯去皮，挖芽眼，洗净，切片。称200 g放入1 000 mL自来水中，用文火煮沸30 min，双层纱布过滤)，蔗糖20.0 g，NaCl 1.5 g，琼脂15 g，蒸馏水定容到1 000 mL;③发酵培养基:CMC-Na 10.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母提取物2.0 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离筛选［6］将样品混匀后取约5 g置于含50 mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，30℃、150 r/min震荡摇匀15 min，静置30 s后取1 mL菌液梯度稀释至10-3、10-4、10-5，涂布于分离培养基上，接种量为0.05 mL，每1处理设3个重复。30℃培养2～3 d，从有明显水解透明圈的菌落边缘小心挑出菌丝接种到改良PDA培养基上，反复接种数代直至获得纯培养物。最终筛选到1株有明显水解透明圈的真菌，命名为Z-2-4。

1.2.2 菌种鉴定①形态学鉴定:真菌形态学鉴定依据魏景超编著的《真菌鉴定手册》［7］;②基因组DNA提取及ITS、β-微管蛋白、钙调节蛋白基因的扩增和测序:对获得的纯培养物菌株使用BIOMIGA真菌基因组抽提试剂盒提取总DNA，然后用于目的基因的扩增。真菌ITS区部分序列的扩增采用通用引物ITS1/ITS4［8］、β-微管蛋白(β-tubulin)序列的扩增采用通用引物Bt2a/Bt2b［9］、钙调节蛋白(calmodulin)序列的扩增采用通用引物cmd5/cmd6［10］。扩增程序如下:94℃5 min;94℃45 s，54℃45 s，72℃1 min，30个循环;72℃10 min。取2 μL PCR产物，1%琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物经纯化后，送交测序公司测序，利用BLAST软件将测定得到的基因序列与NCBI数据库进行序列比对分析，获取相近典型菌株的基因序列，然后用CLUSTAL X软件进行全序列比对，利用MEGA3.0中的邻接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系统发育树［11］。

1.2.3 粗酶液的制备及纤维素酶活(CMC酶活)的测定［12-13］将纯化菌种接种到PDA平板上培养3 d，用6 mm打孔器打孔，取3块含纯化菌种的琼脂块接种到装有200 mL发酵产酶培养基的250 mL三角瓶中，30℃、225 r/min摇床振荡培养3 d。培养液于4℃、6 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液。将其置于25 mL的具塞刻度玻璃试管中，加入0.5 mL适当稀释的酶液，50℃恒温水浴预热2 min后，加入2.0 mL用pH 4.8醋酸缓冲液配制的1%羧甲基纤维素钠溶液，50℃恒温水浴酶解30 min，然后加入2.5 mL的DNS于沸水浴中5 min，流水冷却后定容至25 mL混匀，在520 nm下测定其吸光值，对照标准曲线后测算酶活力。酶活力按照国际单位规定定义为每分钟催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 菌株Z-2-4形态学特征

菌株Z-2-4在PDA平板培养基上生长较快，30℃条件下培养3 d菌落直径达35～40 mm，菌落呈圆形，有放射状沟纹，形成同心环纹，边缘白色，中间浅黄色，气生菌丝茂盛，菌落背面呈黄色(图1A)。分生孢子头球形，直径40～50 μm，分生孢子近球形，直径2.0～2.5 μm，壁粗糙(图1C)。将该菌株接种到羧甲基纤维素钠-刚果红平板培养基上，在30℃培养3 d后，可形成直径25 mm的水解透明圈，表明该菌株具有较高的纤维素降解活性(图1B)。根据《真菌鉴定手册》，菌株Z-2-4依形态学特征初步鉴定为曲霉属(Aspergillus)。

图1 菌株Z-2-4形态特征Fig.1 Morphological characteristic of Z-2-4 strain

2.2 菌株ITS、β-微管蛋白、钙调节蛋白基因序列分析

为了进一步确定该菌的分类地位，在形态学的基础上对其进行了分子生物学鉴定。用通用引物扩增其ITS、β-微管蛋白、钙调节蛋白基因并进行测序分析，将测序结果与NCBI数据库BLAST比对，选取同源性较高的菌株进行系统发育分析，结果见图2、3、4。结果显示:该菌的ITS序列与其亲缘关系最近的Aspergillus insulicola(EF661430.1)只有94%的相似性，β-微管蛋白序列与Aspergillus insulicola(FR775320.1)的相似性为89%，钙调节蛋白序列与Aspergillus insulicola(EF661396.1)的相似性为93%，推测该菌为Aspergillus属的一个潜在新种。

图2 菌株Z-2-4的ITS rRNA基因序列系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Z-2-4 based on the ITS rRNA sequences

图3 菌株Z-2-4的β-tubulin基因序列系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Z-2-4 based on the β-tubulin sequences

图4 菌株Z-2-4的calmodulin基因序列系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Z-2-4 based on the calmodulin sequences

2.3 菌株Z-2-4粗酶液酶学性质的初步研究

2.3.1 温度对CMC酶活力的影响为明确菌株Z-2-4分泌的纤维素酶最佳反应温度，调节温度分别为20、25、30、35、40、45、50、60、70、80℃，pH值为7.0，测定不同温度下的酶活力。以最高值为100%，用相对酶活力对温度作图(图5)。从图5中可以看出，菌株Z-2-4所分泌的纤维素酶在30～60℃下，具有较高的相对酶活力，在80℃下相对酶活仍约有50%，表明此纤维素酶具有较高的耐高温能力。此菌分泌的胞外纤维素酶最佳反应温度条件为40℃。

图5 温度对菌株Z-2-4酶活力的影响Fig.5 Effects of temperature on the enzyme activity of Z-2-4 strain

2.3.2 pH值对CMC酶活力的影响为明确菌株Z-2-4纤维素酶反应最适pH值，用pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲溶液配置1%的CMC底物溶液，测定不同pH值下的CMC酶活力。以最高值为100%，用相对酶活力对温度作图(图6)。从图6中可以看出，菌株Z-2-4所分泌的纤维素酶在pH 4.0～8.0均有较高的相对酶活力，达到70%～100%。说明此菌分泌的纤维素酶适应pH值较宽，其中最适pH值为6.0。

图6 pH值对菌株Z-2-4酶活力的影响Fig.6 Effects of pH value on the enzyme activity of Z-2-4 strain

2.3.3 不同发酵时间对CMC酶活力的影响将纯化菌种接种到PDA平板上培养3 d，用6 mm打孔器打孔，取3块含纯化菌种的琼脂块接种到装有200 mL发酵产酶培养基的250 mL三角瓶中，30℃、225 r/min摇床振荡培养，然后分别在1、2、3、4、5、6、7 d取粗酶液在40℃、pH 6.0条件下测定其CMC酶活。从图7中可以看出，该菌从第2天开始大量产酶，CMC酶活迅速升高，在第4天达到最高值2.57 U/mL，随后CMC酶活逐渐降低。纤维素酶是一种诱导酶，只有当酶的作用底物或其类似物存在时才能合成。当菌种刚接种到发酵培养基中时，由于菌体主要进行自身的繁殖以及其细胞内编码纤维素酶的基因表达较低，故其初期酶活较低;随后纤维素酶得到大量表达，其酶活性在短时间内迅速升高;最后，由于底物的消耗以及代谢产物的反馈抑制作用使纤维素酶的表达受到抑制，纤维素酶活随之逐渐降低。

图7 时间对菌株Z-2-4酶活力的影响Fig.7 Effects of incubation time on the enzyme activity of Z-2-4 strain

3 讨论

在自然界中，许多细菌、真菌、放线菌、原生动物等都能产纤维素酶。但细菌、放线菌和原生动物所产纤维素酶量较少、纤维素酶系不完全且多数属于胞内酶;而丝状真菌所产纤维素酶为胞外酶、产酶效率高且纤维素酶系较完善。故国内外关于产纤维素酶菌种的研究主要集中在真菌方面，如里氏木霉、康氏木霉、黑曲霉、米曲霉等。曲霉属菌株在自然界分布广泛，是重要的发酵工业和食品加工业的菌种，现已被利用的多达60余种。目前，国内外有关曲霉属产纤维素酶的研究报道较多，且主要集中于黑曲霉(Aspergillus niger)［14-15］，而来源于红树林生态系统的产纤维素酶曲霉却未见报道。本文从海南省三亚市红沙河口红海榄植物根际土壤中分离筛选得到1株纤维素降解真菌，命名为Z-2-4。形态学初步鉴定结果为曲霉属(Aspergillus sp.)，其ITS、β-微管蛋白、钙调节蛋白基因序列与其亲缘关系最近菌株的相似性分别为94%、89%和93%。推测该菌为Aspergillus属的一个潜在新种。菌株Z-2-4所产纤维素酶的最佳反应温度为40℃，最佳反应pH值为6.0，产纤维素酶活力最高出现在发酵第4天时，达到2.57 U/mL。该菌分泌的胞外纤维素酶具有较强的耐高温能力以及较好的pH值稳定性，具有广阔的工业应用前景。

致谢感谢中国科学院海洋微生物研究中心资源与信息库对本研究的大力支持。

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