四种植物提取液抑菌作用的分析

刘 伟，王 冰，周丽威，宋金枝，顾地周

(通化师范学院 生物系，吉林 通化 134002)

植物合成芳香簇化合物的能力几乎是无限的，其中大部分是酚类物质和它们的衍生物[1].其中绝大多数是次生代谢产物，现在分离到的至少有12000种以上，约占自然界中总数的10%[2].其中的大多数化学物质如萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、独特的氨基酸和多糖等均具有杀虫或抗菌活性[3].

长白山区地处北温带和寒温带气候类型，植物资源非常丰富.我们选取了四种长白山区常见的植物作为研究对象，研究其对三种植物病原细菌的杀菌活性.其中白屈菜、胡桃楸、细叶杜香为长白山区野生有毒植物资源[4].白屈菜为罂粟科白屈菜属植物，主要有效成分是生物碱类物质，包括白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、黄连碱等[5].已有关于其对抑制植物病原真菌活性的研究[6]，发现其对蘑菇根霉病菌菌丝生长有显著的抑制作用；也有研究白屈菜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌抑菌活性的报道，发现白屈菜提取液对这些病原菌有明显的抑制作用[7].白屈菜的有效成分中，以白屈菜红碱的研究最多，范海延等人对白屈菜红碱进行了提取并测定了其抑菌活性，发现它对多种植物病原真菌有抑菌活性[8].同时，也有研究发现，胡桃楸[9]、细叶杜香[10]、蒲公英[11]具有一定的抑菌活性.但对植物病原细菌的抑菌活性研究相对较少，本文利用上述四种植物提取物，对三种黄单胞菌属植物病原细菌的抑菌作用进行研究，为进一步开发利用植物源杀菌剂提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物.白屈菜(ChelidoniummaiusL.)、蒲公英(Taraxacum)，采于通化师范学院附近山区；细叶杜香(LedumpalustreL.var)、胡桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)采于白鸡腰国家自然保护区.白屈菜取地上部分(茎叶)和地下部分(根)分开采集、处理；蒲公英取全草；细叶杜香和胡桃楸取叶.

供试菌株.甘蓝黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)、水稻细条病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)由广西大学生科院提供.

培养基.NYGB培养基用于甘蓝黑腐病菌的培养.OB培养基用于水稻白叶枯病菌的培养.NB培养基用于水稻细条斑病菌的培养.

1.2 试验方法

(1)植物材料的采集及提取液的提取.将采集的植物洗净泥土和杂质，置于室内阴凉通风处阴干，干燥后的植物用粉碎机粉碎，过筛.每种植物各称取100g，加入2L蒸馏水浸泡12h后，文火熬三次，后两次均加水1L熬到200ml左右，合并滤液，用多层纱布过滤，再用滤纸过滤，加热浓缩至100ml，制成水剂.用细菌过滤器过滤两次，得到质量浓度为0.5g/ml的植物提取液的母液，放4℃冰箱中备用.

(2)菌悬液的制备.将金甘蓝黑腐病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌分别接种NYG、OB、NB液体培养基中，28℃，200rpm摇床过夜培养，选取处于对数生长期的菌体，测OD600，调整OD600=1.0，稀释涂板，菌落计数.

(3)最低抑菌浓度的测定.取供试药液母液，浓度为0.5g/ml，以此浓度用相应培养基进行2倍稀释，以培养基加入相应药液为空白对照，培养基加入菌液做阴性对照，培养基加入菌液和卡那霉素作为阳性对照.在96孔细胞培养板内加入相应量的培养基和药液，配成浓度依次为0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml的溶液，分别加入20μl菌液(菌液浓度约为108cfu/ml)，在96孔板内混合后，置于28℃恒温培养箱内培养48h后观察结果，空白对照和阳性对照应为没有浑浊的澄清溶液，阴性对照为浑浊液体，没有浑浊孔中的最低药液质量浓度为样品对供试细菌的最低抑菌质量浓度(MIC).所有实验均重复三次.

(4)带药培养基的制备.取已制备好的植物提取物母液4ml加入到6ml已灭菌的固体培养基中，摇匀，倒入灭菌培养皿中配成终浓度为0.2g/ml的固体带药培养基.其他浓度依此方法分别配成终浓度为0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml的固体带药培养基.

表1 4种植物对三种植物病原菌的最低抑菌浓度

注：+表示细菌能够正常生长，-表示细菌不能够正常生长。

2 结果与分析

2.1 抑菌试验结果

采用96孔板法[12]测定了四种植物对三种植物病原细菌的抑菌作用，同时用带药平板法对最低抑菌质量浓度进行检验，结果与96孔板法基本一致.白屈菜、胡桃楸、蒲公英的提取液对三种植物病原细菌都有一定的抑菌活性，而细叶杜香的提取液对三种植物病原细菌都没有抑菌活性.白屈菜(茎叶)和蒲公英提取液的抑菌效果相似，抑菌效果最好，胡桃楸和白屈菜(根)提取液的效果稍差.

2.2 四种植物对植物病原细菌的最低抑菌浓度

通过最低抑菌浓度测定可知(见表1)，白屈菜(茎叶)和蒲公英提取液对Xcc、Xoc、Xoo三种植物病原细菌的最低抑菌浓度均为0.1g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml，其中对Xoo的抑菌效果最好；白屈菜(根)提取液对三种植物病原细菌的最低抑菌浓度均为0.2g/ml；胡桃楸提取液对三种植物病原细菌的最低抑菌浓度分别是0.1g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml，其中对Xoc的抑菌效果要差一些.

3 结论与讨论

通过四种植物提取液对三种黄单胞菌属植物病原细菌抑菌活性的测定，发现白屈菜、胡桃楸和蒲公英对三种细菌都有不同程度的抑菌效果，而细叶杜香在本实验中未发现有抑菌活性.不同植物提取液对三种细菌的抑菌活性相差较大，而同一植物对三种细菌的抑菌活性基本相近.虽然目前对白屈菜及其生物碱抑菌活性研究较多，但对其不同部位有效成分含量尚没有深入研究，本研究中其地上部分提取液的抑菌效果要好于地下部分，其地上部分有效成分含量应高于地下部分.此前，胡桃楸在医药方面开展了一些研究，通过本文说明其对植物病原细菌也有一定的抑菌活性，对其抑菌活性成分及抑菌机理方面的研究有待开展.已有多篇文献报道蒲公英对植物病原真菌具有显著的抑菌作用，本研究丰富了蒲公英的抑菌谱，可为其开发提供参考依据.

不同植物所含有效成分各异，对于不同提取方法得到的有效成分含量也不同，所以利用不同提取方法提取有效成分，进行抑菌试验的效果有所差异.为了防止高温导致有效成分的分解，在对植物样品烘干时避免使用高温烘干、提取液除菌时使用细菌过滤器而未采用高压灭菌.但实验中细叶杜香未发现有抑菌活性，这可能与提取物的有效成分有关，在以往的研究中细叶杜香挥发油成分具有抑菌活性[10]，本文中所用提取方法会导致挥发物质损失，所以检测不到细叶杜香的抑菌活性，也进一步证实，细叶杜香的抑菌活性成分存在于挥发油中.现在对于植物抑菌作用的报道较多，但是真正存在于这些植物体内的抑菌活性物质是什么？主要分布在植物哪些部位？还有待深入研究.

参考文献：

[1]Geissman T A.Flavonoid compounds，tannins，lignins and related compounds. In:Florkin M and Stotz EH (eds).Pyrrole Pigments，Isoprenoid Compounds and Phenolic Plant Constituents[M]. New York:Elsevier Press，1963.

[2]Schultes R E.The kingdom of plants;The importance of herbaria，botanical gardens and exploration;Plants as chemical factories;The future of plants in medicine.In (Ed.W.A.R.Thomson)Medicines from the earth[M].New York:McGraw-Hill Book Co.，1978.

[3]Marjorie M.Plant Products as Antimicrobial Agents[J].Clin Microbiol Rev，1999，12(4):564-582.

[4]周繇.长白山野生有毒植物资源的研究[J].山西大学学报，2003，26(3):260-264.

[5]黄松，杜方麓.罂粟科白屈菜族的化学成分及植物化学分类依据的研究进展[J].湖南中药导报，2002，8(10):582-584.

[6]李明，杜强，王艳.四种药用植物对植物病原真菌的抑制作用[J].中国生物防治，2008，24(增刊):81-84.

[7]宋瑞佳，侯伟倬，杨杰，等.白花曼陀罗和白屈菜水浸液杀菌效果研究[J].安徽农业科学，2010，38(9):4941-4942.

[8]范海延，薛广厚，吕春茂，等.白屈菜中白屈菜红碱的提取及抑菌活性[J].食品科学，2009，30(24):129.

[9]闻平，陈蕾，俞晓丽，等.胡桃楸提取物抗白念珠菌作用的机制研究[J].中药药理与临床，2008，24(1):51-53.

[10]谈华，刘庆华.细叶杜香挥发油抑菌和杀菌作用的研究[J].齐齐哈尔大学学报，2005，21(3):33-36.

[11]刘利本，平家奇，高海飞，等.蒲公英不同部位提取物体外抑菌作用的比较[J].延边大学农学学报，.2010，32(1):65-68.

[12]王大海，姬志勤，魏少鹏，等.冬凌草中抑菌成分研究[J].农药，2010，49(6):410-412.