CO2激光辐照诱变选育纳豆芽孢杆菌高抗菌活性菌株

黄纯纯 陈建军 张巧央 柴央央 蒋王辉 葛永达

（台州职业技术学院生物与化工学院，浙江 台州 318000）

激光又名光微粒，它是一种量子流。通过激光辐射可产生热、光、电磁效应及压力等综合效用，它能引起细胞RNA或DNA结构发生变化，从而直接或间接地影响生物有机体的生理功能，促使细胞代谢活动的改变，以致使细胞显现出突变的性状［1］。

纳豆菌是作为生产纳豆的菌种，它属于革兰氏阳性好氧菌［2］。通过纳豆菌发酵所得的大豆人们称之为纳豆，它具有非常丰富营养价值，具有很好的保健功能，在溶血栓、抗菌等方面都具有非常好的功效［3］，可以说是药食兼用。对于纳豆菌代谢产物的抗菌活性的研究始于第二次世界大战，日本对纳豆菌的研究展开较早，当前世界上很多国家也都加入到纳豆菌的研究工作中。现阶段国内的研究重点主要集中在纳豆激酶各方面，关于纳豆菌抗菌作用的研究报道较少［4］。本研究采用红外CO2激光辐照纳豆芽孢杆菌筛选得到高抗菌活性突变株，其抗菌活性提高显著，从而为纳豆菌在抗菌领域，甚至可以说是天然生物防腐剂的开发研究方面提供一定的科学依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

用于生产出发菌株是纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis nattoS252；用于生物效价分析测试的指示菌是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

1.2 培养基

蛋白胨牛肉膏培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂18g、氯化钠5g，用蒸馏水定容至1L，pH 7.2±0.1。实验时可用于生产菌株的斜面种子培养；同时可用于指示菌斜面及平皿培养。（液体蛋白胨牛肉膏培养基不加琼脂，其他组份相同）。液体种子培养基：葡萄糖4g，氯化钠为4g，酵母膏4g，胰蛋白胨8g，牛肉膏4g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0±0.1。实验时可用于生产菌株种子培养。液体发酵培养基：胰蛋白胨5g，玉米浆3g，葡萄糖5g，甘油10g，可溶性淀粉8g，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾4g，氯化钠3g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0±0.1。实验时可用于生产菌株发酵培养。

1.3 菌种活化

挑1环Bacillus subtilis nattoS252菌种，接至新鲜斜面培养基内，置28℃培养24h后，配制成每毫升含1.5×103个细胞的悬液，移取2mL至安培管内供照射使用。

1.4 CO2激光照射

取激光束光斑直径为0.4cm设定照射距离为23cm，照射时间依次设定为5s，10s，15s，20s，25s，30s，35s，40s，对照组照射时间设定为0s，平行3组，确定最佳辐照剂量。

1.5 辐照菌株培养

用生理盐水将最佳条件的照射菌株悬液稀释成原浓度的10-1～10-6倍，然后移取0.2mL涂布平皿，每种稀释度用3个平皿。置于28℃下培养24h后，挑出形态大小不同的单菌落，在与平皿等同条件下进行斜面培养。从斜面上挑几环菌体接入到液体种子培养基，置于28℃下培养18h后，移取2mL种子液接入液体发酵培养基，置于32℃下培养36h得发酵液。液体种子培养及发酵培养时装液量均为20mL/100mL摇瓶，摇床转速180r/min。

1.6 指示菌悬液制备

挑取几环活化后的斜面指示菌分别接入至各液体培养基中，置于37℃下培养24h即得菌悬液，采取10倍稀释法稀释，测出菌浓，而后用无菌水将之稀释成105～106个/mL用作平皿涂布。

1.7 抗菌活性的检测方法-管碟法［5］

将上述所得的发酵液在8000r/min，30min下离心分离即得上清液，作为抗菌粗提液。将浓度为105～106/mL的指示菌悬液涂在装有固体培养基的平皿上，放上牛津杯，吸取200μL抗菌粗提液至牛津杯。置于37℃培养24h后，测量出透明抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 菌体致死与CO2激光照射时间之间的关系

在一定照射距离下，采用CO2激光照射、菌体致死率与照射时间的关系见图1。微生物在诱变过程中，当致死率在75％～80％范围时，正向突变率被普遍认为是较高的［6］。据此本实验采用30s作为该菌株的CO2激光照射时间。

2.2 CO2激光照射纳豆芽孢杆菌诱变筛选结果

本实验应用红外CO2激光辐照纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis natto S252，辐照效果明显，获得5株抗菌活性较高的突变株，结果见表1，表1中的数值是3次平行实验均值，其中突变株F604抗菌活性最高，它的抗菌活性对指示菌金黄色葡萄球菌及大肠杆菌较出发菌株分别提高1.26倍和1.43倍。有可能是对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制是由不同抗菌物质所造成。

表1 高抗菌活性异变株筛选结果Table 1 Screening results of mutant on high antibacterial activity

2.3 突变株F604抗菌活性的稳定性实验

将通过红外CO2激光辐照得到的高抗菌活性突变株F604作继代抗菌活性稳定性实验，每隔2代测一数据，结果见表2，表2中的数值是3次平行实验均值，表明此突变株F604的抗菌活性在传代过程中较为稳定，更加说明了在微生物诱变上采用红外CO2激光辐照技术是可行的。

表2 突变株F604传代过程中抗菌活性稳定性试验Table 2 Stability test of mutant F604 on antibacterial activity during subculture

3 结论

红外CO2激光辐照能引起细胞RNA或DNA结构发生变化，从而直接或间接地影响生物有机体的生理功能，促使细胞代谢活动的改变，以致使细胞显现出突变的性状。本次实验使用红外CO2激光辐照纳豆芽孢杆菌Bacillus natto S252，筛选得到1株抗菌活性较高的突变株F604，它的抗菌活性对指示菌金黄色葡萄球菌及大肠杆菌较出发菌株分别提高1.26和1.43倍，说明在微生物诱变育种过程中应用CO2激光辐照射技术具有广阔的发展前景。

［1］胡卫红，陈有为，李绍兰，等.激光辐照微生物的研究概况［J］.激光生物学报，1999，8（1）：66-69.

［2］鲍艳玲，倪孟祥，钱之玉，等.纳豆激酶摇床发酵条件的优化［J］.药物生物技术，2005，12（1）：19-21.

［3］梁淑娃，夏枫耿，彭中健，等.纳豆激酶液体深层发酵技术的研究［J］.现代食品科技，2007，23（6）：1-3.

［4］钟青萍，余世望，梁胜媛.纳豆菌的抗菌作用及其培养基的优化［J］.食品工业科技，2001，22（5）：20-22.

［5］岑沛霖，蔡谨.工业微生物学［M］.北京：化学工业出版社，2000：10-100.

［6］沈同，王镜岩.生物化学［M］.北京：高等教育出版社，1991：176-177.