壳聚糖修饰羊毛防毡缩用蛋白酶的制备及其酶学性质

陈忍忍， 袁久刚， 余圆圆， 范雪荣， 王 强， 朱怡然

（江南大学 生态纺织教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

壳聚糖修饰羊毛防毡缩用蛋白酶的制备及其酶学性质

陈忍忍， 袁久刚， 余圆圆， 范雪荣， 王 强＊， 朱怡然

（江南大学 生态纺织教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

为了减少防毡缩整理中蛋白酶对羊毛纤维主体结构的破坏作用，利用水溶性碳二亚胺将壳聚糖大分子偶联到蛋白酶（Savinase 16L）分子上，增大蛋白酶分子量，从而将水解作用限制在纤维表面。研究结果表明，壳聚糖修饰后蛋白酶的二级结构更加规整，整体结构更加紧凑；Km从20.62 g／L提高到35.21 g／L，表明其对底物的亲和力变小；修饰酶的最适温度为55℃，在该温度下的热稳定性较好，且在70℃以上的高温下，修饰酶显示出优于未修饰酶的稳定性。

壳聚糖；蛋白酶；碳二亚胺；化学修饰；酶学性质

羊毛纤维表面覆盖着致密的鳞片层，由于纤维间的定向摩擦效应，使得毛织物在洗涤过程中，发生严重的毡缩现象，导致织物尺寸缩小。传统的氯化防毡缩整理虽然可以达到较好的防毡缩效果，但是会产生有机氯化物等对环境有害的物质。因此，环境友好的生物酶防毡缩整理方法越来越受到重视［1－3］。

生物酶防毡缩整理主要是利用酶分子对羊毛纤维表面鳞片的水解作用，破坏鳞片层，达到防毡缩目的。羊毛防毡缩用蛋白酶Savinase 16L分子量相对较小，只有26－29 k Da，很容易通过鳞片间隙的细胞膜复合物层扩散进入纤维主体，水解细胞间质，对纤维强力造成严重损伤［1，4－5］。相关研究表明，通过化学修饰使蛋白酶分子量增大到一定程度，则可将酶的作用范围限制在纤维表面，降低对纤维主体的损伤［1］。

已报道的可用于酶修饰的大分子有聚乙二醇（PEG）及其衍生物、环糊精（Cyclo－ dextrin）、葡聚糖（Dextran）、壳聚糖（Chitosan）等［6－7］。其中，壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，基本单元是带有氨基的葡萄糖，分子链上分布着大量羟基和氨基，性质活泼，是比较合适的大分子修饰剂。目前，以壳聚糖为固定化载体，戊二醛为交联剂，将酶固定化的研究较多［8－9］。但在均相体系中，将壳聚糖大分子与蛋白酶偶联以改变蛋白酶性能的研究还未见报道。由于大分子的规整性和氢键作用，壳聚糖只能溶于稀酸中，不溶于水和绝大多数有机溶剂，因此，壳聚糖改性的物质可以随着环境p H值的变化而改变其溶解性［10］。本文正是利用该性质，实现壳聚糖修饰酶与未修饰酶的分离纯化。

EDC（1－ethy－3－（3－dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride）是可溶于水的碳二亚胺，具有活化羧基的作用，可以引发羧基和伯胺的缩合反应［4］。本文利用EDC活化蛋白酶分子的羧基，使之与壳聚糖分子中的伯氨基之间发生缩合反应，形成壳聚糖－蛋白酶偶联物，从而达到增大蛋白酶分子量的目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要实验试剂Sephacryl S－200凝胶填料：北京拜尔迪公司提供；蛋白酶（Savinase 16L，16 000 U／g）：Novozymes公司提供；壳聚糖（脱乙酰度≥90%，粘均分子量约40万）：国药集团化学试剂有限公司产品；碳二亚胺（EDC，纯度≥98.5%）：上海晶纯实业有限公司产品；其他化学试剂均为分析纯。

1.1.2 主要实验设备MF99－3自动液相色谱分离层析仪，层析柱（内径1.6 cm，长50 cm）：上海沪西分析仪器厂产品；F－4600荧光分光光度计：日本Hitachi公司产品；MOS 450圆二色谱仪：法国Biologic制造。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白酶的化学修饰壳聚糖对蛋白酶的化学修饰过程如图1所示。

图1 EDC将壳聚糖偶联到酶分子上的反应历程Fig.1 Modification of protease with chitosan

参照文献［10－13］的方法对蛋白酶进行修饰和分离纯化。先将壳聚糖溶解在1%（W／V）醋酸溶液中，配制成20 g／L溶液，备用。配制反应液，调节p H至4，最终体系中含有5%（V／V）蛋白酶、8 g／L壳聚糖。先在室温下震摇30 min，充分混匀后，加入40 mmol／L EDC，继续于室温反应4 h。反应结束后，用50 mmol／L Tris－HCl（p H 8.5）缓冲液调节溶液p H至弱碱性，使产物沉淀。再将其以4 000 r／min的速度离心10 min，弃去上清液，将壳聚糖－蛋白酶偶联物分离出来。

1.2.2 酶活和蛋白质浓度测试采用酪蛋白为底物，测试蛋白酶在37℃的活力。酶活测定采用紫外分光光度法［14］，将每分钟催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸的酶量定义为一个活力单位。

蛋白质浓度测试采用考马斯亮蓝法［15］。

1.2.3 体积排阻色谱检测利用紫外检测仪在280 nm检测蛋白酶的出峰时间。洗脱液为20 mmol／L醋酸－醋酸钠缓冲液（p H 4.5），其中含有150 mmol／L氯化钠。

1.2.4 荧光光谱分析激发波长为280 nm，狭缝宽度均为5 nm，测定蛋白酶在250～500 nm内的发射光谱。

1.2.5 圆二色性谱图（Circular dichroism measurements，CD）分析扫描波长范围190～250 nm，响应时间为1 s，比色皿光程为1 mm。

1.2.6 米氏常数（K m）的测定采用 Lineweaver－Burk双倒数法，固定蛋白酶浓度，测试在不同底物浓度下的初速度，以1／［V］为纵坐标，1／［S］为横坐标作图，求出Km。

2 结果与分析

2.1 洗脱谱图分析

由于蛋白酶自身既含有羧基又含有伯胺基，在EDC的作用下，很可能发生自身交联。为了验证该交联反应是否会发生，按照相同的修饰配方和反应条件，在不加壳聚糖的情况下，将EDC加入蛋白酶溶液中进行反应。反应结束后，取EDC修饰和壳聚糖修饰反应液进行凝胶层析实验，结果如图2所示。

图2 修饰酶和未修饰酶的体积排阻色谱洗脱曲线Fig.2 Size exclusion chromatograms of modified and native Savinase

比较洗脱曲线1和2可以发现，未修饰酶（SAV）只有一个峰，而 EDC修饰酶（EDC－SAV）反应液有两个洗脱峰。经检测，EDC－SAV反应液的两个峰都有酶活，且第一个峰的出峰时间比SAV提前约20 min，第二个峰应该是在交联反应中没有被修饰的酶，其峰值比反应前小。这说明在EDC的作用下，反应液中出现了新的大分子量物质，很有可能蛋白酶分子自身发生了交联反应。实验中发现，随着反应时间的延长，EDC－SAV反应液洗脱曲线中，第一个洗脱峰的峰值逐渐变大，而第二个峰值不断减小。

在单独EDC修饰反应中，进行蛋白酶活力测试，发现随着反应时间的延长，酶活并没有发生明显变化。这表明，分子间交联反应没有对酶的活性中心造成影响。

壳聚糖分子中含有大量伯胺基，当酶分子被大量壳聚糖分子包围时，在EDC的作用下，理论上可以形成以酰胺键连接的壳聚糖－蛋白酶偶联物。比较壳聚糖修饰酶（CS－SAV）反应液和壳聚糖（CS）溶液的洗脱曲线可知，前者也有两个洗脱峰。第一个峰的出峰时间虽然没有比单独壳聚糖溶液明显提前，但在280 nm的吸收增大，这表明部分蛋白酶被偶联后分子量变大，提前被洗脱出来。同时由于壳聚糖相对分子质量（40万）比较大，且分布比较宽，与小分子量的蛋白酶偶联后，分子量分布并没有发生显著变化，造成出峰时间与壳聚糖相比没有太大区别。第二个峰是反应中未被修饰的蛋白酶，随着反应时间的延长，峰值逐渐变小。

2.2 圆二色性光谱（CD）分析

在远紫外区进行CD测试，观察蛋白酶被修饰后的构象变化。CD谱的变化直接反应了蛋白质二级结构的变化。图3为修饰前后蛋白酶的CD谱图，表1为根据图3计算得到的各结构单元的百分含量。

图3 修饰酶和未修饰酶的圆二色性谱图Fig.3 Circular dichroism spectra of modified and native Savinase

表1 修饰后蛋白酶二级结构变化Tab.1 The secondary structure of modified Savinase

从图3可以看出，SAV的椭圆度［θ］在220 nm处达到最低值，EDC－SAV的最低值也在220 nm，而CS－SAV在217 nm处值最小，峰位发生蓝移。结合表1可以发现，未修饰酶分子以α－螺旋构象和无规卷曲为主；单独EDC修饰后，酶分子的各结构单元含量均未发生变化。为了更好地说明壳聚糖修饰后蛋白酶分子的结构变化，直接将蛋白酶与壳聚糖按照修饰配方物理混合（CS＋SAV）后进行CD测试，发现α－螺旋和β－折叠等各结构单元含量基本不变；加入EDC使壳聚糖与蛋白酶偶联后，α－螺旋的含量从34.8%提高到80.6%，而无规卷曲的含量下降到15.3%，β－折叠和转角的含量也相应减少，说明CS－SAV的二级结构发生了较大变化。

2.3 荧光光谱分析

在天然蛋白质分子结构中，酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）这3种氨基酸会发射荧光。由于Tyr、Trp和Phe侧链的疏水性，一般情况下，这些基团分布在蛋白质内核的疏水区［16－17］。修饰和未修饰酶的荧光发射光谱如图4所示。

在280 nm的激发波长下，未修饰酶的最大发射波长为340.4 nm；EDC修饰后，最大发射波长未发生变化；壳聚糖与蛋白酶物理混合后最大发射波长红移到346.4 nm，荧光强度下降了70.9%；壳聚糖修饰酶的最大发射波长为345.4 nm，荧光强度比未修饰酶弱，稍强于两者直接物理混合的荧光强度。在280 nm处激发产生的荧光，主要是色氨酸残基的荧光发射［16－17］。上述现象，可能是由于壳聚糖修饰后，蛋白酶的结构更加紧凑，色氨酸被包埋的更深所致。此外，单独EDC修饰蛋白酶后，荧光强度也有所降低。殷海波在半乳糖修饰葡萄糖氧化酶的研究中也发现类似现象，即修饰酶的发射峰位红移，荧光强度明显降低［18］。

图4 修饰酶和未修饰酶的荧光发射光谱Fig.4 Fluorescence emission spectra of modified and native Savinase

综上可知，单独EDC修饰后，蛋白酶的结构和性质变化都不大。因此，接下来的实验中均只研究壳聚糖修饰后蛋白酶的酶学性质变化。

2.4 壳聚糖修饰酶的表观米氏常数变化

Km是酶催化反应动力学的重要常数，反映酶与底物亲和力的大小。根据Lineweaver－Burk方程，可计算Km。图5为壳聚糖修饰前后蛋白酶的Lineweaver－Burk双倒数图。

壳聚糖修饰后，蛋白酶的Km从20.62 g／L提高到35.21 g／L，说明CS－SAV与底物酪蛋白之间的亲和力变小。这可能是由于CS－SAV的结构更加规整、紧凑，造成酶分子的活性中心与底物结合时，缺乏与底物结合所必要的分子链柔韧性，构象变化受到限制，从而导致其与底物之间的亲和力减小；也可能是由于蛋白酶被修饰后，酶分子量和体积均增大，底物酪蛋白的分子量也比较大，在空间位阻的作用下，难以与酶的活性中心接近，故表观米氏常数增大［4，19］。

图5 修饰酶和未修饰酶的Lineweaver－Burk图Fig.5 Lineweaver－Burk plot of modified and native Savinase

2.5 温度对壳聚糖修饰酶活力的影响

修饰和未修饰酶在不同温度下的活力如图6所示。

图6 修饰酶和未修饰酶在不同温度下的酶活曲线Fig.6 Temperature－activity profile of modified and native Savinase

从图6可以看出，在p H 6的磷酸盐缓冲溶液（20 mmol／L）中，SAV在55℃时活力最高，并且在70℃以下温度范围内都具有很高活力。蛋白酶与壳聚糖物理混合后，蛋白酶的温度－酶活曲线几乎没有发生变化。壳聚糖修饰后，蛋白酶的最适温度仍保持在55℃；此外，CS－SAV在80℃还能保持最适温度时60%以上的酶活，而SAV在80℃只残留30%左右的酶活，表明CS－SAV的适用温度范围更宽。

2.6 壳聚糖修饰酶的热稳定性变化

蛋白酶的使用温度一般都在其最适温度，故考察在最适温度55℃保温不同时间后，修饰和未修饰酶的稳定性，结果如图7所示。

图7 修饰酶和未修饰酶在55℃的热稳定性曲线Fig.7 Thermal stability profile of modified and native Savinase

由图7可知，SAV在55℃、p H 5的醋酸－醋酸钠缓冲溶液（20 mmol／L）中的热稳定性较好，处理180 min后，仍能保留90%以上的活力；蛋白酶与壳聚糖物理混合后，蛋白酶的热稳定性没有受到显著影响，仅在前90 min内酶活稳定性稍有提高；CSSAV的稳定性也很好，稍高于SAV。这可能是由于壳聚糖共价偶联到酶分子上后，在较高温度下酶分子的构象变化受到限制，减少了分子内部基团的热振动，使其不易失活［16］；也可能是由于壳聚糖的大分子长链包围在酶分子周围，对蛋白酶起到了一定保护作用，导致热稳定性提高［20］，这应该也是造成物理混合后蛋白酶热稳定性稍有提高的原因之一。但是，由于SAV在55℃的热稳定性已经很好，故CS－SAV热稳定性提升的空间并不大。

3 结语

1）在EDC的活化作用下，蛋白酶分子自身发生交联，但是该反应并不影响蛋白酶的活力，修饰后蛋白酶的结构也未发生明显变化。

2）从圆二色谱计算结果可知，壳聚糖修饰后，蛋白酶分子中无规卷曲的含量从32.1%下降到15.3%，无规卷曲减少，表明蛋白酶的二级结构更加规整。

3）荧光发射光谱分析表明，壳聚糖修饰后，蛋白酶的最大荧光发射波长从340.4 nm红移到345.4 nm，且荧光强度显著降低，揭示了修饰酶的结构更加紧凑。

4）根据Lineweaver－Burk方程计算可知，壳聚糖修饰后，蛋白酶的Km从20.62 g／L提高到35.21 g／L，说明修饰酶与底物之间的亲和力变小。

5）壳聚糖修饰酶的最适温度没有发生变化，仍为55℃，而在70℃以上高温下的稳定性得到提高，适用范围变宽。

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Preparation of Chitosan Conjugated Protease Used for Shrink Resistance of Wool and Its Properties

CHEN Ren－ren，YUAN Jiu－gang，YU Yuan－yuan，FAN Xue－rong，WANG Qiang＊，ZHU Yi－ran

（Key Laboratory of Science and Technology of Eco－Textile，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Chitosan was covalently coupled to protease（Savinase 16L）with water－soluble carbodiimide to enlarge its molecular weight，with the purpose of reducing enzymatic damage to wool fibres in anti－felting finishing.It was found that the secondary and the whole structures of the modified protease were much more regular and compact than the native one.The conjugated protease presented a lower affinity towards casein with an increase in Km from 20.62 g／L to 35.21 g／L.There was no change in optimum temperature（55℃）for the modified protease while its thermal stability at 55℃ was improved.Compared to the native enzyme，the modified protease displayed higher stability above 70℃.

chitosan，savinase 16L，EDC，chemical modification，enzymatic properties

TS 201

A

1673－1689（2012）05－0505－06

2011－05－09

国家863计划项目（2008AA02Z203）；国家自然科学基金项目（51073073）；江苏省自然科学基金项目（BK2009073）；江苏省高等学校优秀科技创新团队项目（苏教科2009－10号）。

＊

王强（1973－），男，黑龙江佳木斯人，教授，硕士研究生导师，主要从事纺织生物技术研究。E－mail：qiang＿wang＠163.com