microRNAs在肺癌研究中的进展

丁 罡综述 黄 钢审校

在世界范围内，肺癌的发病率明显增高。在欧美某些国家和我国大城市中，肺癌的发病率已居男性各种肿瘤的首位,每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%，确诊时多为晚期，尽管手术、化疗、放疗技术不断提高，但NSCLC患者的预后仍很差，总体5年生存率低于20%[2]。miRNAs几乎参与调节细胞的各个生物过程，包括发育、造血、器官形成、细胞凋亡、细胞增殖和肿瘤的发生、发展。在肿瘤组织中，miRNAs表达异常。MiRNAs既可起癌基因功能，又能作为抑癌因子。在肺癌组织中miRNAs有特定的表达谱，参与调节肿瘤血管生成等多个过程，并可作为生物标志物用以早期诊断，靶向治疗及临床预后。本文就miRNA的结构和生物学特性，在肺癌中的研究进展综述如下。

1 miRNA的发现

1993年，Lee、Feinbaum和Ambros等发现在线虫体内存在1种RNA(lin-4)，是1种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制1种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。7年后科学家又发现了第2个miRNA-let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程，Let-7最早在G.elegans体内发现。在线虫C.elegan中，Let-7具有调控发育的时序及细胞增殖，在哺乳动物中也发现相同功能的基因，表明miRNA 进化上是比较保守的。

2 miRNA的产生及作用机制

miRNA通常是在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录的，在核内编码miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录成具有茎环结构的初级产物miRNA(pri-miRNA)。初级产物miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下形成由70个核苷酸组成的miRNA前体。转运蛋白5将miRNA前体输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切，产生约为22个核苷酸长度的双链miRNA。成熟miRNA 可形成RNA诱导沉默复合物(RISC)。miRISC依据miRNA与同源mRNA碱基互补配对的程度而启动不同的作用机制，对完全配对的2个序列，miRISC对靶mRNA 进行剪切，对部分配对的2个序列，miRISC阻断mRNA 的翻译并降解mRNA，从而产生基因沉默。miRNA 不仅可引起转录后基因沉默，而且可引起转录前和转录期间的多重沉默[3]。

3 miRNA与肺癌的关系

3.1 miRNA与肺癌的发生和机制

肺癌中miRNA的作用模式(与miRNA相连的实线表示下调作用，虚线表示上调作用)

3.1.1 癌基因或抑癌基因 miRNA具有组织特异性，与肺组织相关的包括let-7a、miR-34、miR-21、miR-143、miR-145、miR-31、miR-146等40余种[4]。最近研究[5]证明，miRNAs与多种肿瘤的发生、发展密切相关。miRNA既可作为抑癌基因(miR-15a、miR-16-1、let-7等)下调原癌基因的活性；也可作为癌基因(miR-155，miR-17-5p，miR-21等)下调抑癌基因的活性。Johnson等发现let-7miRNA与RAS的3'端相结合，使人类细胞中RAS表达下降，与正常肺组织相比，let-7在肺癌组织中呈低表达。在肺腺癌细胞中恢复胞内let-7水平抑制了肿瘤细胞的生长，从而表明let-7可能在肿瘤发展过程中具有抑癌基因作用。Garofalo 等[6]在NSCLC 的研究中证实，miR-221 和miR-222 的表达水平在TNF 相关凋亡诱导配体( TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)抵抗的NSCLC 细胞中升高。

3.1.2 DNA甲基化 DNA甲基化是最早发现的表观遗传学修饰途径之一，基因组甲基化受DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的调控。DNA甲基化能引起染色质结构改变，影响DNA构象及DNA稳定性，还能使DNA与蛋白质相互作用方式发生改变，从而调控基因表达。MiR-370 作用于白介素-6(IL-6)，受DNA甲基化酶1 及HASJ4442 的影响，而miR-34b 及miR-34c 由于甲基化不足，影响p53 相关基因的功能[7]。Fabbri等[8]研究发现，miR-29在肺癌组织中表达降低，并且miR-29 的表达量与DNMT3A 和DNMT3B呈负相关。在肺癌细胞中miR-29抑制两者表达，可防止DNA过度甲基化，因此，miR-29可使抑癌基因去甲基化而正常表达，从而抑制肿瘤生长。

3.1.3 血管生成 癌细胞的生长、转移依赖新生血管的形成，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最有效的促血管生长因子。肿瘤细胞能分泌VEGF等促血管生长因子，诱发血管内皮细胞增殖，逐步形成新生血管。Fish等[9]发现内皮细胞中高表达的miR-126调节内皮细胞对VEGF的反应。剔除斑马鱼体内的miR-126后将导致胚胎发育过程中血管完整性的降低及出血。增加Spred-1表达或抑制VEGF均得到与剔除miR-126类似的结果。此外，Liu等[10]研究发现miR-126在肺癌组织中低表达，将miR-126转染到肺癌细胞后，发现miR-126可下调VEGF的表达并抑制肺癌细胞的增殖。随后将稳定表达miR-126的肺癌细胞皮下注人裸鼠体内，与对照组相比，实验组的肿瘤生长得到明显抑制。有证据表明miRNA在某些肿瘤类型中起着调节RTKs的作用。EGFR在一些肿瘤类型中如肺癌中过表达，因此，在肺癌或者其他恶性肿瘤中利用针对EGFR的靶向药物来抑制其活动。

3.2 miRNA与肺癌的早期诊断

正常组织和肿瘤组织中miRNAs表达明显改变，且miRNAs在不同肿瘤中具有特定的表达模式，miRNAs在肿瘤中表达的这些特点为肺癌的诊断开辟了一条崭新途径，并且已经在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中得到证实[11]。

Wei等[12]应用RT-PCR 法，研究63例NSCLC患者和30例健康对照组血浆中的miR-21 表达情况，NSCLC患者的血浆miR-21 水平明显高于年龄、性别匹配的对照组。Liang的研究表明miR-34b/34c/449在肺腺癌中阳性检测率为87%，鳞状细胞癌为82%[13]。Yanaihara 等[14]共发现6 种miRNAs( miR-205、- 99b、- 203、- 202、- 102 和- 204-pre)在肺腺癌和肺鳞癌中的表达存在显著差异这些研究表明，miRNAs可能是以正常组织生理活性为背景诊断恶性生长的1种有效工具。另外发现，miRNA表达与细胞分化水平相关。Mascaux等[15]利用荧光支气管镜活检正常组织、异常增生、原位癌、浸润性鳞癌等不同病理过程组织，发现miR-32、miR-34c表达呈线性下降，miR-142-3p、miR-9则上升。

循环中miRNAs对于肿瘤诊断的效用也得到了研究，突出了它们作为肿瘤检测的非侵入性诊断工具的潜能。一项研究对肺癌及结肠癌患者中特定的血清miRNA表达谱进行了鉴定，而且miR-25和miR-223在一个75例健康捐赠者及152例非小细胞肺癌患者的独立实验中得到了验证，提示miR-25和miR-223可以作为非小细胞肺癌的诊断标识物[16]。有报道称其他miRNAs如miR-141和miR-21分别对前列腺癌的发生具有预测作用并可作为诊断B细胞淋巴瘤的生物学标志物[17]。

Let-7a miRNA在NSCLC细胞和组织中有异常表达已被证实。Chen等[18]发现血清中包括let-7在内的miRNA水平稳定，重现性好，其血清水平可较好地指示包括癌症在内的多种疾病，可以作为潜在的生物标志物检测各种癌症和其他疾病。Jeong 等[19]应用RT-PCR 方法分析35 例NSCLC 患者和30 名健康对照组血清中的let-7a 表达情况，发现NSCLC 患者的let-7a 表达水平明显低于健康对照组； 而且血清学let-7a 低表达者肿瘤组织中的let-7a 水平也呈低表达。

3.3 miRNA与肺癌的治疗

对由miRNAs调节的复杂网络进行深入研究将有助于鉴定其他用于预测现行治疗方法的miRNAs，并为临床医生对患者进行分层并将个性化治疗方案最优化提供额外的工具。

放疗是目前肺癌治疗的常用方法之一。Weidhaas等[20]在体外培养的肺癌细胞和线虫体内过表达let-7，发现其辐射敏感性增高，辐射诱导的细胞死亡增多；而降低let-7水平则产生辐射抵抗。Shin 等[21]在分析电离辐射后A549 细胞中miRNAs表达变化后证实，A549 细胞接受20 Gy和40 Gy放射后，miRNAs分别有4 种和10 种改变，并且这些变化的miRNAs与放射引起的细胞凋亡、细胞周期调控等有关。

靶向疗法的出现意味着特殊肺癌亚型的分子分类可以进一步指导个体化治疗模式并改善患者的预后。Bertino 等[22]提出了"miRNAs的药物基因组学"的概念。拮抗miRNA(antagomir)是一类治疗性RNA 分子，其功能是抑制miRNA的发挥作用。如用antagomir-17-5p 给药2周，30% 的肿瘤得到彻底抑制[23]。用1种miRNA抑制剂antagomir[24]处理致瘤性miR-17-5p导致30%的小鼠发生完全的肿瘤衰退[23]。在小鼠和灵长类动物的其他研究结果表明，使用锁核酸替换抑制剂可以有效地沉默miR-122，而且胆固醇结合也没有证据表明治疗相关的细胞毒作用[25]，支持这些方法在临床应用中的发展。大量研究[26]已经表明，表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor，EGFR) 过度表达和( 或) 激活与NSCLC 患者生存期短及预后差及放化疗敏感性下降密切相关，EGFR 与miRNAs间的关系已经成为肺癌研究的一大热点。

针对miRNAs的作用机理开发肺癌特异性的治疗药物，在一些研究实验中显示了令人鼓舞的效果，不同于miRNA变种DNA，miRNA抑制剂不被miRNA的生物通路处理。这些抑制剂化学性的改变单股寡核苷酸对成熟miRNA的互补。这种化学修饰包括硫代硫酸、2'-O-甲基化[27]和锁核酸替换增加了它们对核酸酶降解作用的耐受。这些抑制剂可以结合到RISC复合体中成熟的miRNA并作为竞争性抑制剂发挥作用，但也可以结合pri-miRNA 或pre-miRNA并消除它们的加工，从细胞核出来或结合到RISC复合体。总而言之，基于miRNA的治疗方法具有巨大但未实现的潜能。

3.4 miRNA与肺癌的预后和转移判断

miRNAs主要参与肿瘤的发生和发展，提示这些调节因子可能对于获取诊断及预后信息有特别的作用。当前研究表明，经miRNA谱分析的肿瘤与正常组织相比，具有不同的miRNA表达[28]，且认为miRNA可作为肺癌预后判断指标。Yu等[29]对112 例NSCLC 患者进行检测，通过Cox 模型和风险评分发现了5 个预测NSCLC 治疗效果的miRNA 信号。一项在肺癌中的研究表明mir-155高表达及let-7a-2低表达与患者预后有关[30]。一项143例肺癌切除患者的独立研究表明let-7的低表达的患者生存期显著缩短，而与肺癌的分期无关[31]。

一些其他类型的miRNAs也可能具有诊断及判断预后的价值。这些miRNAs包括保护性let-7和miR-221以及高危险的miR-137、miR-372和 miR-182，它们可以用于预测肺癌患者生存的可能性。Gallardo 等[32]分析了70 例NSCLC 患者的肿瘤组织，发现miR-34 家族在肿瘤组织中表达下调且与术后复发率高有关。多项研究结果表明大多数保护性的miRNAs在肺癌中的表达通常是下调的，而与高风险有关的miRNAs的表达往往上调[33]，这种miRNAs的差别表达可能具有诊断意义及判断预后的价值。Hu等[34]最近研究报道基于Solexa 测序方法在血清中检测出的4 种miRNAs组合( miR-486、-30 d、-1 和-499) 能够准确预测Ⅰ至Ⅲa 期NSCLC 患者的预后。

关于miRNA的研究日趋成熟，问题正由miRNA是否在肿瘤中区别表达转向miRNA是否具有治疗效用。人类肿瘤谱已经鉴定出与风险、诊断、预后和治疗反应相关的标记。与正常组织相比恶性肿瘤细胞中高度保守的非编码基因的区别表达为疾病的进展提供更好的理解。目前尚无系统研究miRNA与肺癌的发生发展的关系，miRNA 与基因表达调控方式的精细调节机制还不清楚，miRNA在细胞生长发育中的作用机理亦不清楚，这一领域正进入系统生物学，通过它们相互作用及功能把我们从单一miRNAs及一种或几种主要靶点的研究带入对调节网络更全面的探索，并将miRNAs整合到已存在的信号通路、代谢、蛋白质相互作用及基因调节网络。

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