VEGF-C，VEGF-D在乳腺癌中的表达及其与淋巴结转移及预后的关系

赵迎春 李 勇 朱永云 罗传瑜

近年来我国乳腺癌的发病率呈持续上升趋势、死亡率占女性恶性肿瘤死亡率的第2位[1]，严重威胁女性健康。乳腺癌的淋巴结转移是其最主要的转移形式，也是临床评估乳腺癌患者病情及预后的重要指标，但乳腺癌淋巴结转移机制目前尚不十分明确。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和VEGF-D 以及位于淋巴管内皮上的血管内皮生长因子受体(VEGFR-3)是目前公认的调控淋巴管生成最为重要的信号传导通路的生长因子，能够诱导淋巴管的生成及肿瘤细胞的淋巴结转移,但其在乳腺癌淋巴结转移及预后中的作用尚不明确。 我们对VEGF-C,VEGF-D在乳腺癌淋巴结转移中的作用以及对于乳腺癌患者预后的影响进一步探讨，以期为预测乳腺癌淋巴结转移及预后提供依据，为乳腺癌的综合治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2005年10月～2006 年10月在芜湖市第二人民医院乳腺外科接受诊断和治疗及资料完整、经手术病理确诊的78例乳腺癌患者为研究对象。全部患者为女性，平均年龄为50.8岁(29～72岁)；其中淋巴结转移者36例，未转移者42例；浸润性导管癌69例,浸润性小叶癌9例；肿瘤直径<2 cm者21例，肿瘤直径≥2 cm者57例；按国际抗癌联盟(UICC)TNM分期Ⅰ期16例，Ⅱ期44例，Ⅲ期18例；患者术前均未接受过化疗、放疗等治疗。以同期送检的30例癌旁组织作为研究对照。

1.2 免疫组化染色

78 例乳腺癌及30例乳腺癌癌旁正常组织蜡块均行4 μm 连续切片，分别作HE和免疫组织化学染色。鼠抗人VEGF-D 多克隆抗体、鼠抗人VEGF-C单克隆抗体购自美国R&D公司，采用免疫组化SP(链霉素亲生物素一过氧化物酶)法,观察血管内皮生长因子C、D在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达。用已知的乳腺癌阳性切片作阳性对照，用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

VEGF-C,VEGF-D阳性染色指显微镜下观察细胞胞质内具有清晰可见的，定位准确的棕黄色颗粒，而背景清晰。每张切片选择有代表性的区域，在100倍视野下观察5个视野，根据阳性细胞染色强度及阳性细胞的面积来判断结果。阳性细胞的染色强度按照无着色、淡黄、棕黄、棕褐色分别记为0,1,2,3分。阳性细胞的面积分为0%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，50%～75%为3分，≥75%为4分。两项乘积0～3分为低表达，≥4分为高表达。

1.4 随诊

患者治疗结束后，前两年每3个月回院复查，以后每6个月复查，未定期复查的通过电话方式随访。截止至2011年12月，所有病例都完成至少5年的随访,78例患者均有完整随访资料。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件包进行分析。各相关因素的差异性比较采用χ2检验，生存分析选用Kaplan-meier法，显著性检验采用Log-rank检验。P≤0.05为差异有统计学意义。所有数据采用SPSS17.0统计软件进行处理。

2 结果

2.1 乳腺癌组织、肿瘤旁正常组织中VEGF-C、VEGF-D蛋白的表达情况

乳腺癌组织免疫组化染色结果显示VEGF-C、VEGF-D蛋白高表达率分别为47.4%(37/78)、32.1%(25/78)；30例乳腺癌旁正常组织中分别有4例和1例高表达，高表达率分别为13.3%(4/30)、3.3%(1/30)，两者蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.01),说明肿瘤组织中VEGF-C及VEGF-D的表达水平明显高于肿瘤周边正常组织。进一步分析肿瘤组织中VEGF-C与VEGF-D表达的相关性发现，VEGF-C与VEGF-D的表达无明显相关性(P>0.05)。

2.2 乳腺癌中VEGF-C、VEGF-D蛋白表达与临床病理因素的关系

78例乳腺癌组织中VEGF-C、VEGF-D蛋白的表达水平与年龄、肿瘤大小、临床分期及ER,PR,Her-2的表达情况无关(P>0.05)。但VEGF-C/D的表达水平与肿瘤脉管内浸润及淋巴结转移密切相关(P<0.05)，见表1。

2.3 VEGF-C,VEGF-D的表达水平与乳腺癌患者的总生存期(OS),无病生存期(DFS)的关系

Kaplan-meier生存曲线显示乳腺癌患者的OS与VEGF-C,VEGF-D的表达水平呈负相关,VEGF-C，VEGF-D高表达者OS明显低于VEGF-C,VEGF-D低表达者，Log-rank检验P=0.024(VEGF-C)和P=0.035(VEGF-D),见图1A,B。同时Kaplan-meier生存曲线显示乳腺癌患者的DFS也与VEGF-C/D的表达呈负相关，VEGF-C/D高表达者DFS明显低于VEGF-C/D低表达者，Log-rank检验P<0.05,见图1C,D。

表1 VEGF-C、D的表达与乳腺癌临床病理因素的关系

图1 VEGF-C/D表达水平与患者OS,DFS关系的生存曲线

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，淋巴结转移被认为是乳腺癌患者最重要的预后指标之一。过去，淋巴结转移被认为是1个被动过程， 脱落的肿瘤细胞通过原有的局部淋巴管的引流到达淋巴结。而目前大量研究表明淋巴管生成作为肿瘤淋巴结转移的机制已被多数学者认可，淋巴管生成受淋巴管生成因子及其受体的介导和调控，VEGF-C和VEGF-D 是最先被确认能在体内介导新生淋巴管生长的生长因子。

VEGF-C于1996年从人前列腺癌细胞系PC3中分离纯化，是最早被发现的促淋巴管生成因子，具有调节血管生成、淋巴管生成和脉管通透性等作用，参与多种生理和病理过程。但目前的多数研究证实VEGF-C通过与其受体VEGFR-3特异性结合后经丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidy1inositol-3 kinase)途径调控淋巴管内皮细胞增生，诱导肿瘤淋巴管生成是各类肿瘤淋巴结转移的重要机制[2]。动物实验及临床研究均发现VEGF-C和VEGFR-3表达增高可促进肿瘤淋巴管生成及增加淋巴管密度，从而促进淋巴结转移，并与诸多瘤体的预后密切相关，包括头颈部鳞癌、甲状腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、结直肠癌等[3～6]。Hu等[7]用免疫组化法检测98例乳腺癌发现VEGF-C表达阳性率为90.8%，且淋巴结转移组VEGF-C表达阳性率显著高于淋巴结转移阴性组，表明VEGF-C与乳腺癌淋巴结转移相关。Huang等[8]用免疫组化及原位杂交法检测89例原发性乳腺癌发现VEGF-C 阳性表达率55.06%，VEGF-C表达与淋巴管密度及腋窝淋巴结转移呈正相关；VEGF-C mRNA表达阳性组淋巴管密度及腋窝淋巴结转移率显著高于VEGF-C mRNA表达阴性组。同时Mohammed等[9]研究认为VEGF-C的表达水平与肿瘤的淋巴管密度，淋巴结转移密切正相关，而且VEGF-C表达水平与患者发生远处转移及总生存率密切相关，VEGF-C表达水平越高患者越可能发生远处转移，总生存率显著降低。Mandriota等[10]和Koptstein等[11]通过对双重转基因小鼠胰腺β细胞模型的研究，发现VEGF-C/VEGF-D高表达的转基因小鼠，能特异性地促进胰岛周围的淋巴管生成及远处转移，提供了VEGF-C/VEGF-D-VEGFR-3信号通路特异性介导新生淋巴管生成、促进肿瘤细胞播散和向区域淋巴结转移的直接证据。本组试验结果显示乳腺癌组织中VEGF-C高表达率为47.4% ，显著高于乳腺良性疾病(P<0.05)，显示VEGF-C在乳腺癌中过表达；乳腺癌VEGF-C蛋白的表达与患者年龄、肿瘤大小、临床分期以及激素受体状态等无关(P>0.05)，但与患者的淋巴结转移以及脉管内侵犯密切相关(P<0.05)，肿瘤发生淋巴管浸润及淋巴结转移，VEGF-C表达水平越高，与近期上述的国内外研究报道基本一致。同时本研究同时发现VEGF-C的表达水平也与患者的总生存率及无病生存率密切相关，这与Nakamura等[12]的研究报道一致，VEGF-C表达水平越高，患者的总生存率及无病生存率越低。上述的研究结果提示VEGF-C可能与淋巴管内皮细胞上VEGFR-3特异性结合，刺激淋巴管内皮细胞增殖，形成新生淋巴管，导致癌周组织中淋巴管密度的增高，为肿瘤的淋巴道转移创造有利条件，而且新生淋巴管管壁较薄，基膜不连续或缺少基膜，更有利于肿瘤细胞播散、存活及转移，从而导致患者更差的生存期。

VEGF-D是Achen等在1998年研究发现的。但目前对于VEGF-D 在乳腺癌中的表达水平，与淋巴结转移的关系以及其预后价值，目前仍存在争议。部分研究结果认为VEGF-D的高表达与恶性肿瘤的淋巴结转移或不良预后密切相关，但也有研究认为两者间没有显著相关性。Koyama[13]和Hanrahan等[14]研究认为VEGF-D的表达水平在肿瘤中并不明显升高，而在正常组织中明显升高，并与患者的淋巴结转移及预后无明显相关性。但大多数研究者认为VEGF-D是肿瘤淋巴结转移的预测因素或者是独立的预后因素。Stacker 等[15]在小鼠肿瘤异种移植模型中证实VEGF-D 能够诱导肿瘤内淋巴管的形成， 此外肿瘤细胞上表达的VEGF-D能够促进肿瘤细胞向淋巴结转移。用VEGF-D的特异性抗体VD1可以阻断VEGF-D介导的淋巴管扩散。同时有研究[16]表明VEGF-D 还是乳腺癌细胞的重要存活因子，表达VEGF-D的乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231能够抵抗由缺氧、星形孢菌素(STS)和环己酰亚胺(CHX)诱发的凋亡， 这可能和Bcl-2表达增加，caspase 活性降低和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)剪切受抑制有关。Nakamura等17]研究也认为VEGF-D在乳腺癌中明显表达增强，并与患者的淋巴管密度及淋巴结转移密切相关，VEGF-D的表达水平与患者的预后呈明显的负相关。上述实验结果的差异性究其原因可能是由于这种生长因子在不同肿瘤内酶解加工的程度不同， 或是同时存在其它淋巴管生长因子的调控机制。另外，不同研究结果间的差异也可能与实验标本本身、实验使用的抗淋巴管标记物或检测方法不同有关。在本研究中VEGF-D在乳腺癌中的高表达率明显升高，提示VEGF-D 在乳腺癌中也是过表达的，同样VEGF-D的表达水平与年龄，肿块大小，临床分期等临床病理因素无关，但VEGF-D 的表达水平与患者的淋巴结转移及脉管内侵犯密切相关，淋巴结转移组及脉管内侵犯组中VEGF-D的高表达率明显高于淋巴结未转移及脉管内未侵犯的患者。同时本研究也发现，VEGF-D的表达水平与患者的总生存率(OS)及无病生存率(DFS)密切相关，这也与Nakamura等[17]的结果相近。

综上所述，本项研究表明VEGF-C，VEGF-D的表达水平与乳腺癌脉管内侵犯及淋巴结转移密切相关，并且VEGF-C、D的表达水平与患者的总生存期，无病生存期也密切相关。通过对VEGF-C、D表达水平的检测或许能够对腋窝淋巴结转移风险和评价患者预后提供一定帮助。但对于两者在乳腺癌中的相互作用以及在乳腺癌的淋巴结转移中所起的作用尚需进一步研究，并希望能够对乳腺癌的淋巴结转移治疗提供新的思路。

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