塞来昔布对肺腺癌A549细胞中COX-2、MRP1表达的影响

方宏娇 牛 伶 鲍扬漪 鲍 健 李晓英

肺癌组织中高表达COX-2，与多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的形成有关[1]。MDR已经明确的机制之一是某些耐药蛋白的过表达，其中MDR1及MRP1研究最多。在人肝癌[2]、小鼠肾癌[3]、人乳腺癌[4]等研究中均提示COX-2参与调控MDR1表达，并介导耐药性的产生。本实验选择高表达COX-2及MRP1的肺腺癌A549细胞株[5]，以Celecoxib为干预因素，观察其对A549细胞株的生长抑制情况及COX-2与MRP1表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人肺腺癌细胞株A549 购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。试剂:Celecoxib (大连辉瑞制药有限公司)；培养基及胎牛血清(Gibco)；胰酶(GICICO)；COX-2引物、MRP1引物、β-actin引物(上海生工技术有限公司)；Trizol试剂、逆转录试剂盒(Fermentas)；PCR试剂和Taq DNA聚合酶(Fermentas)；琼脂糖凝胶(OXOID)；DNA Marker(Fermentas)；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白质定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)；SDS(serva)；甘氨酸(AMRESCO)；PVDF膜(millipore)；电化学发光试剂盒(Pierce)；甲叉双丙烯酰胺(AMRESCO)；一抗兔抗人COX-2单克隆抗体(Biowprlde)；一抗兔抗人MRP-1单克隆抗体(Stan Cruz)；一抗鼠抗人β-actin单克隆抗体、羊抗兔及羊抗鼠(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 主要仪器

细胞培养箱(Thermo Forma 370)；酶标仪(美国BIO-RAD 680)；PCR仪(2720，美国ABI公司)；DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)；TGL-18R冷冻离心机(黑马仪器公司)；GSM凝胶图像分析管理系统(珠海黑马医学仪器有限公司)；PVDF膜、垂直板凝胶电泳及电转移系统(美国Bio-Rad)；HE-120水平电泳仪(中国天能公司) ；垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)；X胶片(Kodak)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 A549细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于5% CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。细胞为贴壁生长，0.125%的胰蛋白酶2 ml消化传代，2天换液并传代一次。

1.3.2 MTT比色法检测Celecoxib对肺腺癌A549细胞活性 取对数生长期A549细胞按104/孔接种于96孔培养板,每孔加液量100 μl。24 h后换液分组干预，设空白调零组、对照组和实验组。实验组：Celecoxib干预浓度分别为0.5、5、25、50、100 μmol/l，每个药物浓度设置6个复孔；干预48 h后，每孔加入5 μg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h，取出培养板，每孔加入DMSO 150 μl，水平摇床振荡10 min，酶标仪检测测定各孔吸光度(A值)。根据以下公式计算细胞生长抑制率,抑制率(%)=1-(实验组A 值-空白组A值)/(对照组A值-空白组) ×100%。

1.3.3 RT-PCR法检测A549细胞COX-2及MRP1 mRNA的表达水平 RNA的提取：每孔取105个细胞接种到24孔板，然后分别用25、50、100 μmol/l Celecoxib干预24 h及100 μmol/l Celecoxib干预12、24、36、48 h。干预后，2000 g离心2 min收集细胞，冷PBS洗涤2次；加入1ml Trizol进行细胞裂解后加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min；4℃ 10000 g离心15 min，吸出上清至另一EP管中；加入0.5 ml异丙醇，颠倒混匀后室温放置10 min；4℃ 12 000 g离心10 min；加入1 ml 70%乙醇洗涤，4℃ 7 500 g离心5 min，弃上清，室温干燥后加入RNase-free水溶解RNA，用核酸蛋白浓度测定仪测定RNA样品的纯度。RT反应：在0.2 ml EP管中，加入总RNA 8 μl、10 μM Oligo(dT)1 μl、RNase-free水4 μl,70℃加热10 min，立即冰浴3 min；随即加入5×M-MLV Buffer 4.0 μl、25 mM MgCl21 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、RNasin 0.5 μl；37℃加热5 min；加入M-MLV 1 μl，混匀后离心，42℃ 60 min，70℃ 10 min，即得cDNA，加入DEPC水80 μl。PCR反应：取上述反应液5 μl，加入到含有10×Taq Buffer 2.5 μl、25 mM MgCl21.5 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、Taq酶 1μl、水13.5 μl的PCR反应管中，分别按试剂盒反应条件进行产物扩增，然后在1.5%琼脂糖凝胶上以120 v电泳30 min，拍照。

1.3.4 Western blot法检测COX-2及MRP1的蛋白表达水平 将106个A549细胞接种于培养瓶中，设50 μmol/l、100 μmol/l Celecoxib、空白组3组，分别干预72 h后提取细胞总蛋白质，采用Bradford法测定蛋白质浓度，然后加入等量的2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴3 min后在SDS-PAGE胶中以100 V充分分离蛋白，100 V恒压湿转至PVDF膜上。TBST洗膜(10 min×3次)，加入5%脱脂奶粉，室温封闭2 h。加入一抗4℃缓慢摇动孵育过夜后，TBST再次洗膜(10 min×3次)，然后加入二抗室温孵育2 h，洗膜后应用发光试剂盒显示蛋白质条带。

1.4 统计学方法

应用SPSS16.0统计软件对数据进行方差统计学分析。

2 结果

2.1 Celecoxib对A549细胞的生长抑制作用

Celecoxib对A549细胞的生长抑制作用呈明显剂量效应关系，随着Celecoxib浓度从0.5 μmol/l 增高到100.0 μmol/l 时，其抑制作用越强，差异有显著性(P<0.05)，见图1。

图1 不同浓度Celecoxib对A549细胞生长抑制曲线

2.2 不同浓度Celecoxib对COX-2及MRP1 mRNA表达的影响

25 μmol/l、50 μmol/l、100 μmol/l Celecoxib分别作用A549细胞24 h后，检测其COX-2及MRP1的mRNA表达水平，结果显示3个浓度Celecoxib 干预后A549细胞中COX-2及MRP1基因表达水平均下降，且Celecoxib浓度越高，其表达水平下降越明显，差异有显著性(P<0.05)，见图2。

100 μmol/l Celecoxib分别干预A549细胞12、24、36及48 h，结果显示，4个时间点COX-2及MRP1 mRNA表达量均有下降，作用时间越长，抑制作用越强，差异有显著性，见图3。

2.3 不同浓度Celecoxib对COX-2和MRP1 蛋白表达水平的影响

50、100 μmol/l Celecoxib干预A549细胞，结果显示，Celecoxib亦可下调A549细胞中COX-2和MRP1 的蛋白表达水平，100 μmol/l组较50 μmol/l组抑制作用明显，有显著性差异(P<0.05)，见图4。

图2 不同浓度Celecoxib对A549细胞中COX-2及MRP1 mRNA表达的影响

图3 对A549细胞作用不同时间COX-2及MRP1mRNA表达情况

图4 不同浓度Celecoxib对A549细胞中COX-2及MRP1蛋白表达的影响

2.4 肺腺癌A549细胞中COX-2 mRNA与MRP1 mRNA表达的相关性

采用Pearson Correlation分析不同影响因素对COX-2、MRP1这对变量的相关变化，结果显示COX-2与MRP1基因表达 (γ=0.981，P<0.01)和蛋白表达(γ=0.884，P<0.01)均显著相关，提示在COX-2和MRP1共同表达的前提下，COX-2表达可能是MRP1表达的一个函数变量，MRP1表达具有COX-2依赖性。

3 讨论

MRP1是ABC家族的主要成员之一，主要是作为药物泵功能将药物泵出细胞外或将药物分离分小隔离体，使药物不能与作用靶点结合而产生耐药[6]。本实验结果亦提示肺腺癌A549细胞高表达COX-2及MRP1，与Kang的实验结果一致。

Celecoxib为高选择性COX-2抑制剂，多项临床研究均提示，Celecoxib联合化放疗能提高放化疗的疗效[7，8]。周丹等[9]研究发现，Celecoxib在体内、外均能抑制肺癌生长。本实验结果也显示Celecoxib对肺腺癌A549细胞有较明显的生长抑制作用，呈浓度依赖性，差异有显著性差异，当Celecoxib浓度为100 μmol/l时，近80%的A549细胞已被抑制。

Celecoxib还可通过下调某些耐药蛋白的表达，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性从而提高疗效。本研究结果显示Celecoxib可下调MRP1 mRNA及蛋白的表达水平，目前研究结果提示其可能通过以下2种方式下调MRP1表达水平：①抑制COX-2及其代谢产物PGE2的合成；②调控磷脂酰肌醇(-3)激酶及蛋白激酶Akt的表达水平或功能[10]。具体是何种途径观点不一，Saikawa等[11]构建了高表达COX-2的结肠癌细胞系TR-5，发现COX-2高表达后MRP-1表达水平亦上调，导致TR-5对顺铂敏感的浓度是原始直肠癌细胞HCT-15的大约3倍。Touhey等[12]发现COX-2抑制剂可抑制MRP的药物泵作用，且COX-2本身也被显著抑制，提示COX-2表达与MRP活性具有高度正相关性。但Kang等[6]研究发现下调MRP1表达所需的Celecoxib浓度要远远高于抑制COX所需浓度，且与COX-2及PGE2表达水平无关，故其认为Celecoxib下调MRP1为非COX依赖途径。本研究中Celecoxib可同时下调肺腺癌A549细胞中COX-2及MRP1 mRNA的表达水平，两者受抑制程度有显著相关性，故考虑Celecoxib可能是通过抑制COX途径下调MRP1活性的。

本研究结果显示，Celecoxib可通过直接抑制肺腺癌A549细胞的增殖及下调耐药基因MRP1基因和蛋白的表达水平，从而发挥抗肿瘤作用，下调 MRP1可能是通过COX依赖途径的。

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